Разварки колесных дисков – что они собой представляют
Разварки – это самые обычные колесные диски, которые выполнены при помощи сварочного аппарата. Материалом служат стандартные штампованные диски для автомобиля. Они используются для того, чтобы появилась возможность использовать более широкие покрышки. Ширина разварок определяется самим владельцем автомобиля, с учетом его дальнейших планов на счет тюнинга.
Очень широким дискам может понадобиться дальнейшая раскатка либо подрезание внутренней кромки колесной арки, либо полное ее удаление, установка специализированных расширителей. Благодаря представленному виду самодельных широких колес можно будет сэкономить значительную сумму денег, которая может понадобиться для покупки фирменных дисков во время приобретения широких шин.
Разварки, по сути, являются очень популярными среди владельцев отечественных автомобилей “классического” производства, так как они являются очень дешевой альтернативой широким дискам.
На большинстве классических моделей 13-дюймового диска заднего привода максимальную ширину дисков можно сделать не более семи дюймов. Это касается моделей ВАЗ 2101-07. Если диски будут использоваться на автомобилях моделей ВАЗ 2108-2115, то можно будет увеличить ширину дисков еще на полдюйма. Диски, которые можно изготовить самим, можно будет устанавливать и на другие марки отечественных автомобилей. Разварками также можно оборудовать и иномарку, при условии, что заводом изготовителем использовались штампованные стальные диски.
Откуда пришло название “разварки”?
Разварки так называются из-за процесса их изготовления. Во время этого процесса диски распиливаются болгаркой, затем они свариваются, включаются дополнительные вставки. Многие считают, что такие колеса можно сделать самостоятельно в своем гараже, при условии, что кроме расходного материала у вас будет в наличии сварочный аппарат, но на практике видно, что при плохо выполненной сварке такие диски не поддаются балансировке.
Есть два основных способа производства разварок.
Первый вариант — между распиленными двумя частями дисков (наружной и внутренней) вваривается полоса необходимой ширины, благодаря которой и определяется итоговая ширина полученной разварки.
Второй вариант – необходимо иметь в наличии два штампованных диска, чтобы создать одну разварку. Стандартные диски необходимо будет разрезать в определенных местах. После этого две отдельные части необходимо сварить друг с другом.
Помимо этого, можно выделить еще один вариант – третий, так называемый комбинированный. Этот вариант является самым длительным и дорогостоящим. В таком случае дополнительной вставкой не ограничиваются, производится перенос ступичной части. Иногда в определенных случаях производится замена внутренней части наружной или наоборот. В настоящее время производством разварок занимаются не только самостоятельно, их можно заказать в небольших фирмах или у кустарей. Вполне приличные диски нужной ширины можно получить за вполне небольшие деньги, причем окрашивать такие диски можно в любой цвет на усмотрение самого владельца автомобиля.
Что касается стоимости изготовления разварок, то она зависит от ряда факторов: какие диски могут использоваться для сборки разварок, какой диаметр этих дисков, сложность конструкции, состояние (новые диски или б/у). Для того, чтобы изготовить обычные 13-дюймовые диски-разварки для отечественного автомобиля из бывших в употреблении дисков, понадобится не более двухсот долларов. При наличии двухсот пятидесяти долларов можно будет приобрести хорошие диски с неплохой резиной. Стоимость комплекта разварок для иномарки будет варьировать от трехсот долларов, все будет зависеть только от дисков и от конкретной марки автомобиля.
Следует отметить, что цены практически всегда при этом завышены. Самым главным недостатком является наличие сварочных соединений. Благодаря огромному выбору широких колесных дисков разных диаметров на современном автомобильном рынке можно подобрать диски для любого автомобиля.
Благодаря разваркам можно обновить облик автомобиля. Самым недорогим способом придать автомобилю более солидный вид является использование разварок. Например, при разварке стандартного штампованного диска 6,5J он становится 10J. Причем итоговую ширину диска можно использовать любую.
Но нужно помнить, что прежде всего, ширина диска будет ограничиваться арками крыла автомобиля. Чаще всего эти арки просто вырезают либо раскатывают, чтобы можно было спрятать под крылом разварки.
Многие автолюбители считают, что есть три составляющие успеха стильного автомобиля:
• на разварки резину следует устанавливать домиком;
• разварки следует выдвинуть за пределы арок крыла;
• выполнить занижение подвески автомобиля.
Для изготовления одного широкого диска необходимо будет использовать стандартный штампованный стальной диск (2 штуки), сварочный аппарат, болгарка, шовный герметик.
Необходимо взять оба диска, у одного диска следует насквозь вырезать болгаркой по красной линии, то есть отсечь наружный обод. Отрезанная часть выкидывается. У первого диска производится только надрез по красной линии на наружнем ободе до внутренней части, практически до середины. Отсоединяется и выкидывается наружный обод. При этом ненужные остатки у дисков убираются болгаркой.
На ступицу заднего моста следует одеть оставшуюся часть от первого диска, зафиксировать ее гайками, затем одеть вторую часть. Второй обод нужно выравнивать по отношению к первому, устранить биение, прихватить сваркой в местах стыков, то есть в четырех точках.
Как делают разварки на ваз
КАК СДЕЛАТЬ РАЗВАРКИ СВОИМИ РУКАМИ — DRIVE2
Что такое разварки? Это диски увеличенной ширины. Машина на таких дисках смотрится более интересно и необычно. Разварки можно сделать из любого диска, чаще всего их делают из обычных заводских стальных штампованных дисков («штамповок»). Давайте разберемся как сделать такой диск.
— диск стандартный стальной(штампованный) – 2 штуки
— болгарка
— сварочный аппарат
— герметик шовный (не обязательно, об этом в самом конце статьи прочитайте)
Рассмотрим первый способ
Берем два обычных штампованных диска и отпиливаем болгаркой или на токарном станке по красной линии.
У второго диска убираем ненужные остатки болгаркой
Оставшуюся часть диска 1 одеваем на ступицу заднего моста, фиксируем гайками и надеваем вторую часть. Выравниваем второй обод относительно первого, устраняем биение, прихватываем сваркой в четырех точках в местах стыка.
Зеленым цветом обозначены места проваривания.
И вот что из этого вышло:
Для бескамерной установки нам просто необходимо герметизировать шов в середине диска. Это конечно стоит делать до покраски. Для этой цели нам подойдет Шовный герметик 3М. В качестве варианта, его можно развести Обезжиривателем.
Внимание! Именно обезжиривателем, а не растворителем или, боже упаси, Уайт-спиритом! Разведенным герметиком мазать швы. Подождать пока встанет, удалить лишнее(стаместка, наждачка и т.п.), и в покраску, чтоб не ржавело и радовало внешним видом.
Второй способ немного отличается от первого. Суть в том что распиливается один диск на две части, и в середину вваривается полоса металла. Этот способ намного экономичнее, ведь нам понадобиться всего один комплект дисков.
Разрезаем диск на 2 части как это показано на рисунке.
Ровно отрезаем полосу металла нужной ширины и гнем ее. Толщина металла на сколько помню 3мм. Гнуть можно как угодно, но лучше специальными роликами. Далее берем часть диска со ступицой и к ней прихватываем полосу сваркой. Ступичная часть хорошо придерживает полосу и задает ей правильное направление.
Далее прихватываем полосу к второй части диска. И провариваем все швы, стараясь сделать так чтоб диск не повело. Хорошо если есть возможность автоматической сварки вращающейся детали — так все гораздо прочнее и предсказуемей.
Зачищаем швы — проверяем что все держится. Хорошо если у вас есть токарный станок чтобы зачистить шов на полке диска в том месте где он будет потом радовать глаз. Это к тому же поможет подправить геометрию диска если она немного нарушилась (а это очень вероятно). Даже если все сделано аккуратно — до покраски желательно получившиеся диски прокатать, чтобы быть уверенным в их геометрии. Наши разварки порадовали качеством и не смотря на кажущийся не очень ровным обод (диски то были б/у) показали минимальное биение.
Далее отправляем диски в покраску. Наши были отпескоструены и покрашены порошковой краской. На той стороне диска что обычно скрыта от глаз шиной было решено оставить усиление шва сварки (т.е. сам шов). На лицевой стороне шов был сточен. Диски собрали без камер и они отлично держат давление, о том как одеть резину на разварки можно прочитать перейдя по ссылке.
Справедливости ради я отмечу, что метод этот универсальный во всех смыслах. Я предположил тут с самого начала, что чаще всего всем надо разваривать диск наружу, чтобы получилась полка и специфичный вид. Но нужды и идеи бывают разные. Разварить диск можно и в другую сторону.
С тестовой разваркой у нас так и получилось. Мы этому были не очень рады в тот момент, но зато теперь можем тут показать вот эти фотки. Швы дополнительно не обработаны и их хорошо видно.
Если включить капельку фантазии — совсем не трудно догадаться, что можно разваривать диск в обе стороны сразу.
Вот ещё вам видео:
А это видео для тех кто думает что разварки не надёжное изделие!
Всем спасибо за внимание! Материалы статьи были позаимствованы здесь!
Разварки на ВАЗ своими руками — Сообщество «Кулибин Club» на DRIVE2
Привет всем! Сегодня хочу поделиться своим опытом изготовления разварок на ВАЗ своими руками.
Девизом сей записи можно считать слова: «дело было в автосервисе, делать было нечего». Вот и решил заморочиться и создать разварки из восьми R13 дисков.
Разварки на ВАЗ своими руками
По уже сложившейся моей традиции привожу список необходимого материала для изготовления разварок на ВАЗ своими руками.
Инструмент:
1 — Болгарка + обязательно защитные очки (!)
2 — Дрель
3 — Сварочный аппарат
4 — Ступица заднего колеса\оправка\токарный станок\специально изготовленная приспособа
5 — Очень прямые руки из того места
Расходники:
1 — Отрезные круги (1,2 мм)
2 — Электроды
3 — Сверло 11,5 мм по металлу
4 — Круг для грубой шлифовки
5 — Краска (+краскопульт — по желанию)
6 — Молоток, зубило, минусовая прочная отвертка
7 — Диски колесные штампованные (более-менее ровные)
8 — Вагон терпения
Прежде чем начать, скажу сразу — хоть со стороны все выглядит предельно просто, не стоит даже начинать без чего-либо, описанного в списках выше. В дополнение также скажу: из полос разварки делать не делал, не делаю и делать не буду — дорого, муторно и менее надежно.
Вот такая гора дисков нам понадобится для работы:
Штампы ждут своей участи
А теперь начнем.
1 — Подготавливаем основу.
Закрепляем диск — основу и отрезаем ненужный кусок металла, чтобы осталась только основа. Пилим очень аккуратно, чтобы не зацепить саму основу.
Готовая основа для разварки с отрезанной лишней частью
Перед тем, как отрезать данный кусок металла с диска — его нужно хорошенько закрепить. Я закреплял на балансировочном станке. Простые смертные могут закрепить на задней ступице авто — разницы особой нет. Единственное — пилить на балансировочнике удобнее) Вот фото уже подготовленной основы для разварки.
Закрепленная основа для разварки
Четко отрезанная основа — металл не запилен
2 — Отпиливаем полки от «доноров»
Здесь все похоже на предыдущую операцию. Разрез производим в том же месте, что и у основы!
Только пилить донорский диск нужно насквозь — чтобы осталась только полка. Основу диска (с отверстиями под болты) можно выкинуть.
3 — Удаляем излишки металла с полки.
Это самый, пожалуй, важный пункт.
Самое простое — высверлить точечную сварку (на четвертом фото очень хорошо видны эти злополучные точки). Но для меня это не вариант — потом отверстия придется заваривать\зачищать\снова заваривать.
Другой способ — стачивать тот самый лишний металл болгаркой с шлифовальным кругом по местам самой точечной сварки. Довольно-таки муторно и сложно, но что делать…
Получим примерно следующее: три точки-три запила. Но на диске у нас четыре группы по три точки => итого имеем 12 точек, уфффь! На разных дисках, кстати, количество точек может отличаться, но не сильно.
Далее — зубилом, либо толстой минусовой отверткой сшибаем лишний пропиленный болгаркой металл. Главное — не выдрать точечную сварку с корнями. Иначе придется заваривать дыру)
Процесс удаления лишнего металла с полки
Полка без металла. На точках видны следы на краске от сильного нагрева во время шлифовки
Вот так выглядит наша полка изнутри. На сильные борозды можно не обращать внимание: они будут исправлены сваркой, но их можно немножко подшлифовать для самоуспокоения.
Полка без металла
После того, как основы подготовлены, а полки избавлены от лишнего металла — соединяем их воедино.
Полки сняты
Полки надеты
4 — Центруем — прижимаем — привариваем нашу основу и полку.
Примеряем, центруем. прижимаем. Берем сварочный аппарат, электроды я использовал 3 мм и привариваем полку к основе. Важно: прихватывать нужно в четырех диаметрально-противоположных местах! Иначе диск поведет и ничего хорошего из задуманного не выйдет. Провариваем диск изнутри и снаружи — здесь советов дать не могу, все итак вроде понятно. После сварочных работ не забываем просверлить сверлом на 11,5 мм отверстие для вентиля!
Ваш покорный слуга занят важным делом
В итоге получим примерно следующее:
Нормальный такой сварной шов
Разварка. Вид снаружи.
Разварки получаются примерно 7,5J. Сравните сами:
Сравнение ширины разварки и стандартного диска ВАЗ
5 — Герметизируем шов и красим наши разварки
Шов спокойно герметизируется шовным герметиком. Да и вообще, если нормально проваривать — герметизация в принципе не понадобится. Либо понадобится, но в маленьких количествах.
Далее — придаем эстетический внешний вид наших разварок. Процесс покраски достаточно прост. Подготавливаем поверхность — шкурим, грунтуем, красим. Лично мне нравится белый цвет, но можно и в 2-3 разных ядовито-кислотных покрасить, кому что нравится.
Готовый покрашенный комплект-2
6 — Надевание резины на разварки ВАЗ
После всех манипуляций с краскопультом и последующей сушкой пора бы и приступить к самому интересному — натягиванию резины на наши разварки и установку оных на авто. Скажу сразу — натягивал в одного и без взрыва. Как? Вот так! 🙂
Забортовываем, как на обычный колесный диск. Единственное — пристально следим, чтобы не порвало резину. Потому что такое возможно с вероятностью процентов в 60. Внимание и терпение — наши лучшие друзья. Далее, для надежности, промазываем борта герметиком. В итоге имеем следующее:
Промазанная ненатянутая разварка
Теперь о том, как я натягивал и накачивал резину на разварки.
Первое — зажимаем диск на разбортовочнике и натягиваем резину к верхнему (наружному) борту разварки. Как только резина села — снимаем почти готовое колесо со станка.
Вот столько надо дотянуть с внутренней стороны
Второе — кладем разварку с почти одетой резиной на пол. Подключаем шланг для подкачки к соску. Давим на резину со всех сторон, подавая при этом воздух. Под моим весом внутренний борт покрышки довольно-таки плотно прижался к внутреннему ободу разварки и колесо нормально накачалось без всяких там взрывов.
Долгожданная резина домиком
Готовый комплект собранных разварок лежит и ждет своего часа установки на авто
Ну и самое трепетное и долгожданное — домкратим тачку и быстренько меняем колеса.
Пара слов о косяках.
Я говорю не про маленькие ошибки, а про неисправимые косяки, которые могут возникнуть в процессе резки\сварки и про последствия оных.
Самое важное — во время резки быть предельно аккуратным. Потому что даже новые диски не являются идеально ровными и может случиться непредвиденный запил с последующим разлетом отрезного круга и, в лучшем случае, дело закончится испугом\ссадиной. Также, если основа будет где-то пропилена до критичного состояния (сквозная дыра\щель), если полка будет отрезана неровно, если основа\полка будут плохо отцентрованы, если режимы для сварки будут выбраны неверно (пережог\недожог и т.п.), то получим очень плохой и корявенький результат, который можно будет только выбросить или сдать на металл.
В остальных случаях, без косяков, все получится должным образом и вполне себе круто и четко.
Итоги: плюсы и минусы разварок на ВАЗ.
Минусы:
1 — Сравнительно дорого и трудозатратно
2 — Если у сварщика руки из ж(_о_), существует вероятность поломки диска — хотя о таких случаях я не слышал, но упомянуть, думаю, стоит.
3 — Нужно раскатывать арки, либо
фото, особенности, назначение и как сделать
Многие владельцы отечественных машин ВАЗ мечтают порадовать своего «железного коня» широкопрофильной резиной. ВАЗ 2114 на разварках и другие модели авто после такого тюнинга имеют не только стильный вид, но и улучшенные ходовые характеристики за счет повышения сцепления с поверхностью дорожного полотна. Желая использовать расширенную резину на 13,14 или 15 дюймов, хозяева машин устанавливают разварки на ВАЗ. Для этой модернизации не обязательно покупать новые колесные диски увеличенной ширины. Можно самостоятельно изготовить разварки, увеличив размер колесного обода.
ВАЗ 2105 на разварках – особенности разварок на автомобили Лада
Наверняка имеются владельцы машин, которые впервые слышат слово «разварки» и не имеют представления, что они собой являют. Однако такой термин хорошо известен любителям автотюнинга, которые увлекаются усовершенствованием автомобилей. Итак, разварками называют штампованные диски, которые имеют увеличенную ширину. Расширенные стальные диски способны изменить облик любой машины.
Облик любой машины способны изменить расширенные стальные диски
Свое название разварки получили из-за особенностей технологии изготовления. Разварки на ВАЗ 2107 и другие модели несложно самостоятельно изготовить из старых дисков. Данный вид тюнинга популярен у владельцев ВАЗов, например, лада на разварках сразу обращает на себя внимание. Самостоятельное изготовление разварок – недорогая альтернатива покупным дискам увеличенной ширины.
Рассмотрим более детально особенности разварок. Автомобили ВАЗ имеют минимальную ширину стандартного диска 5J, а максимальный размер в зависимости от марки автомобиля может составлять 6,5J. Используя обычные диски на 13 дюймов, можно увеличить ширину до 7J с помощью разварок. Четырнадцатидюймовые колеса можно доработать до размера 8J. При желании ширина дисков на 15 дюймов может составить 10J.
Скептики такого тюнинга могут возразить, что колесные арки не позволят установить такие диски с широкой резиной. Однако для автолюбителей изменение размера арки колес не является проблемой. Ведь можно выполнить раскатку крыла или его обрезку.
Желая тюнинговать свой автомобиль, не забывайте, что изготовить разварки можно только из штампованных дисков. Стальные диски можно разрезать, а затем сварить. При этом они не теряют товарный вид и прочность в результате термической нагрузки. Из литых дисков разварка не получится, так как их проблематично разрезать.
ВАЗ 2106 на разварках – преимущества и недостатки
Собираясь установить разварки на ВАЗ 2108 или любую другую модель Лады, тщательно проанализируйте достоинства такого тюнинга и внимательно изучите с какими сложностями придется столкнуться. Ведь, кроме преимуществ, разварки на ВАЗ 2109 и остальные модели имеют серьезные недостатки.
Спортивные очертания приобретает тюнингованный автомобиль
Итак, рассмотрим вначале положительные моменты от использования расширенных колесных дисков.
Главные плюсы:
- тюнингованный автомобиль приобретает спортивные очертания и нестандартный внешний вид;
- повышается коэффициент сцепления за счет увеличенного пятна контакта шины с дорожным полотном;
- увеличивается проходимость автомобиля, который не только лучше держит дорогу, но и способен передвигаться по бездорожью;
- значительно повышается управляемость транспортного средства благодаря применению широкопрофильной резины;
- возрастает стоимость тюнингованного автомобиля, что позволяет получить дополнительную прибыль во время продажи.
Однако многие специалисты критикуют разварки и считают, что у расширенных колес недостатков намного больше, чем достоинств.
Основные минусы разварок:
- повышенная вероятность разрушения самостоятельно выполненного сварного шва во время движения машины по ухабистой дороге;
- увеличенный расход топлива за счет резкого возрастания коэффициента сопротивления качению;
- необходимость дополнительных расходов по усилению элементов подвески, нагрузка на которые возрастает;
- ускоренный износ автомобильных покрышек, установленных на самостоятельно сваренных колесных дисках;
У тюнингованного автомобиля увеличивается проходимость
- ухудшение динамических характеристик автомобиля, который медленнее разгоняется из-за широких колес;
- преждевременный износ подшипников колес, вызванный увеличенной нагрузкой на автомобильные оси;
- возможные проблемы во время проверки технического состояния автомобиля и остановки представителями ГИБДД.
Кроме того, придется столкнуться со сложностью покупки широкой резины, ведь обычные колеса к такому диску уже не подойдут. Не забывайте, что изменение конструкции диска отрицательно повлияет на его прочностные показатели. Согласитесь, что цельный диск намного прочнее, чем сваренный из двух половин независимо от качества выполнения сварочных работ. Составной диск нельзя назвать безопасным.
Имеется еще один, пусть небольшой, но все же недостаток. Двери, зеркала и борта автомобиля с разварками будут сильно загрязняться. Даже после небольшого дождя машину придется мыть, поскольку грязь с выступающего за плоскость крыла колес сильно разлетается.
Как сделать ВАЗ 2114 на разварках
Разберемся как сделать разварки. Для этого можно воспользоваться одним из двух указанных методов:
- расширением стандартного колесного обода за счет вваривания в центральную часть полосы из стали;
- увеличение размера колесного диска путем сварки двух половин от подходящих по размеру дисков.
После завершения сварочных работ нужно зачистить сварочный шов и покрыть поверхность герметиком. Остается установить резину, отбалансировать колеса и посмотреть, как будет смотреться ВАЗ 2112 на разварках или ВАЗ 2110 на разварках. Любая модель, в том числе и девятка на разварках станет стильной и приобретет схожесть со стремительным спортивным автомобилем.
Итог
Решив заняться колесным тюнингом, не торопитесь, проконсультируйтесь со специалистами и еще раз оцените, насколько велики достоинства, и к каким последствиям могут привести изменения. Целесообразно доверить изготовление разварок специалистам, которые качественно выполнят сварочные работы, влияющие на безопасность эксплуатации машины. Однако, будьте готовы к проблемам с переоформлением, снятием с учета и неприятным общением с представителями ГИБДД при остановке транспортного средства. Так что есть о чем поразмыслить…
Разварки своими руками — Лада 2105, 1.5 л., 1996 года на DRIVE2
1
Сделали разварки наконец-то.Сразу скажу огромной спасибо моим друзьям Артему, который заваривал мне все это дело и обеспечил болгарками, дисками и самое главное металлом для пластин, и Денису, который помогал все это дело бить кувалдой, пинать заготовки, матюхаться на весь гараж и пыхтеть изгибая пластину, и позже натягивая резину на диск, без них эта ебо**я с дисками была бы намного дольше и дороже.
Так как не было у нас ни балансировочного станка, ни трубогиба, то пришлось немного повозиться. Вырезали болгаркой пластину шириной в 85 мм и в длину обрезаем до 98 см (потом еще придется подрезать на 2-4 см в зависимости от ситуации), болгаркой и человеческими руками из металлического листа железа в 3 мм. Диск разрезали на машине, поддомкратив заднюю ось и включив 2 передачу.На один диск уходило 3 маленьких круга в 125 мм или одна треть большого круга на большой болгарки. Сразу даю напутствие, когда режете диск на пополам на машине, не отрывайте болгарку от диска, разрезайте одним разом и равным нажатием, не прилагая большого усилия на диск, тогда разрез будет идеально ровный без отклонений и заусенцев.НО так как нам нужен ровный диск, то нам нужно промерить каждую половина диска штангенциркулем и саму пластину и убедиться, чтобы на каждой детали не было отклонений в ширине больше чем на 1 мм, тогда он будет более менее ровный и похож на заводской.Выбираем наименьшую ширину каждой половины диска, а остальную часть шлифуем болгаркой до этой ширины.
2
Если обод будет чуть-чуть гулять восьмеркой, то это норма (в пределах разумного) на езде это не отразиться и если вы посмотрите на стандартный диск, то поймете, что он тоже не идеально ровный. Конечно можно заказать идеально ровную пластину с завода, но это деньги да и плюс нужно искать место, от куда это возможно будет сделать.
3
Как только прихватили начало пластины на большую часть диск, то начинаем гнуть ее рукой и пыхтеть, а другой человек сваркой прихватывает стыки диска и пластины и так до конца. Если вы гнете пластину руками как я (чего бы я не советовал), то она будет согнута и загнута слегка во внутрь, из-за чего вам придется на глаз херачить молотком изнутри, придавая ей больший диаметр, ну а дальше, примерно подогнав все это дело, ставили второе внешнее кольцо диска и на глаз ставите одну точку.
4
Потом все это дело ставите на машину, включаете 1 передачу (или 2) и смотрите как крутиться 2 крайних точки диска, а именно два обода, именно они нам важны, так как на них садиться и упирается резина, внутри как и сама пластина может быть вся кривая, но обод должен быть ровно приварен. Для этого (оооочень зае…но) нужно мерить каждую сторону уровнем и выравнивать их, после, попытки примерно с 3, вы найдете баланс в ободах и опять прихватите точками, чтобы не повело.
Ну после финишной проверки, обвариваем диск, может так получиться что щели будут доходить до 8 мм между пластиной и верхним диском (все из-за того, что пластину гнули рукой и она получается элипсно-подобной) и счищаем болгаркой сварной шов, смотрим где недоварили и еще раз обвариваем. После чего финишно зачищаем швы изнутри. Снаружи в идеале сварки быть не должно и она туда даже не вылезет, так что там можно смело пескоструить (или как я шкурить на машине ) и красить. Если же есть косячки на месте стыка пластин, то все исправит автомобильная шпаклевка.
5
6
7
Ширина диска получилась 8.5 J резину натянули 175/70 R 13 НО с камерой, так как такую узкую резину натянуть на такой диск без камеры невозможно. Такую резину можно натянуть на диск шириной максимум 9 J.
Мой радостный друг с готовыми разварами
Как сделать разварки своими руками
Среди автолюбителей очень распространено тюнингование колёсных дисков — так называемое изготовление разварок. Оно заключается в следующем: ширина дисков увеличивается для того, чтобы получить возможность использовать более широкую резину. У разварок есть плюсы и минусы и по сути, этот метод можно считать кустарным, однако он широко используется среди умельцев.
Среди его преимуществ называют следующие факторы:
- улучшение сцепляемости колеса с дорогой, за счёт чего повышаются ходовые качества автомобиля;
- невысокую стоимость таких дисков;
- придание машине более стильного внешнего вида;
- возможность изготовить разварки своими руками.
Однако перед тем как сделать разварки, необходимо учесть, что у них есть и недостатки:
- увеличение момента инерции колеса из-за изменения массы и размера;
- необходимость использовать нестандартную резину;
- снижение прочности конструкции колеса из-за наличия сварных швов;
- ухудшение управляемости автомобиля из-за использования колёс с изменёнными характеристиками;
- необходимость использовать покрышки нестандартных размеров.
Если всё это не убедило вас в необходимости эксплуатировать штатные изделия автомобильной промышленности, давайте рассмотрим, как можно изготовить разварки самому в домашних условиях. Сделаем это на примере колеса r13 для автомобиля ВАЗ — этот пример может считаться универсальным.
Недостатки использования разварокПодготовка
На начальном этапе нужно полностью уяснить себе весь ход процесса. Следует знать, что исходным материалом для изготовления служат штампованные колёса для автомобиля. Литые не подойдут, поскольку в процессе будут вестись сварочные работы — литые изделия не переносят термических нагрузок.
Ширина обода у дисков может быть увеличена 2 способами:
- в середину вваривается стальная пластина;
- из двух обычных дисков, разрезанных пополам, сваривается один широкий.
Вам следует прикинуть, какую ширину дисков допускает конструкция вашего автомобиля. Для автомашин ВАЗ обычно выбирают ширину 7j. Но если вырезать или раскатать арки колёс, то можно довести ширину и до 10 j. Итак, для начала нужно рассчитать ширину обода, которую мы хотим получить.
Если мы решили воспользоваться методом сваривания двух дисков, нужно это учесть и запастись их необходимым количеством — для каждой разварки понадобятся 2 диска.
Первый этап: режем и варим
Вначале придётся выполнять резку металла и сварку – для выполнения этих работ понадобится соответствующее оборудование, а также навыки обращения с ним. Итак, мы запаслись нужным количеством дисков, болгаркой и сварочным аппаратом — теперь можем приступать к работе. Поэтапно процесс сваривания 2 дисков выглядит следующим образом:
- Отрезаем при помощи болгарки обод снаружи первого колеса.
- Отрезаем обод снаружи второго колеса.
- Устанавливаем первый диск на ступицу заднего моста и крепим его.
- Надеваем вторую часть и выполняем выравнивание, устраняя биение.
- В четырёх точках сваркой фиксируем контакт.
- Завариваем шов по всей окружности — это нужно для того, чтобы обеспечить необходимую прочность конструкции.
- При помощи болгарки зачищаем шов сварки снаружи и внутри. Следует помнить, что от качества зачистки будет зависеть балансировка колеса.
Если мы ввариваем внутрь стальную полосу, то процесс будет выглядеть похоже, однако некоторыми деталями будет отличаться:
- Отрезаем наружный обод до внутренней части колеса.
- Вырезаем стальную полосу нужного размера и гнём её по окружности — для этого лучше всего использовать ролики. Они обеспечат нужную точность.
- Устанавливаем диск на ступицу и сваркой фиксируем на нём стальную полосу.
- На полосу навариваем внешний обод так, чтобы не произошло деформации.
Этап второй: герметизация
Теперь нам необходимо загерметизировать полученные болванки, чтобы появилась возможность надеть на них резину. Герметизация особо важна, если мы планируем обойтись без установки камеры. Если же мы ставим камеру, то герметизация необязательна, но сварной шов должен быть гладким и исключать возможность повреждения камеры.
Разварка дисков своими рукамиЗаключительный этап: покраска
И последней стадией является покраска. Однако перед этим этапом нужно выполнить проверку разварок на биение и прокатать их. Убедившись, что всё в порядке, можно думать о покраске.
После того как вы выбрали подходящую эмаль, наносите её следующим способом:
- Старательно шлифуйте поверхность изделия.
- Выполняйте обезжиривание при помощи уайт-спирита.
- Наносите слой средства для грунтовки – оно заполнит все микронеровности и повысит адгезию, обеспечит лучшую сцепляемость краски с металлом.
- После высыхания грунтовки наносите эмаль в несколько слоёв.
- Когда краска высохнет, желательно покрыть её лаком – такое покрытие будет более долговечным и эстетичным.
Заключение
Самостоятельное изготовление разварок — процесс довольно ответственный. Выглядит он несложно, однако для его выполнения нужны определённые навыки и специализированное оборудование. Очень важно контролировать правильное выполнение всех пунктов и следить за тем, чтобы полученные разварки не давали биения.
Как сделать разварки на ВАЗ своими рукамиПомните, что от прочности конструкции и её характеристики зависят не только ходовые качества автомобиля, но и ваша безопасность на дороге. Поэтому важно соблюдение всех мелочей, а также тщательный контроль качества полученных изделий и их эксплуатационных характеристик.
[democracy]
[democracy]
Автор: Баранов Виталий Петрович
Образование: среднее специальное. Специальность: автослесарь. Профессиональная диагностика, ремонт, ТО легковых авто зарубежного производства 2000-2015 г.в. Большой опыт работы с Японскими и Немецкими авто.
Изготовление разварок — DRIVE2
Доброго времени суток!
Всегда чтил советский автоспорт. Кольцевые гонки — любимая дисциплина. Разварки хотел всегда — но сделать было негде, сам варить не способен, а покупать — стоили всегда необоснованно дорого.
Дальше были японские автомобили, а там своя JDM культура.
Совсем недавно приступил с приятелем supermechanik к постройке кольцевой классики в «Национальный» ( о проекте чуть позже). Столкнулись с проблемой отсутствия «ништяков». Необходимы были титановые тарелки клапанов, план шайбы под «вентиля», втулки под ступичный 08 подшипник и т.д. Мониторинг вариантов заказа показал, что варианта не много:
-дико дорого
-откровенный колхоз
Появилась идея организовать своё производство.
На данный момент готовы различные план шайбы, титановые тарелки все отечественные автомобили и конечно несколько комплектов разварок (www.drive2.ru/cars/lada/2…4899916394579155015/#post первый образец). О них подробнее:
Делается всё на коммерческом заводе металлоконструкций. Из ресурсов: много станков и грамотных людей, порошковая покрасочная и большая печь, выходы на все металлы, выход на пескоструй и многое другое…
токарный станок
ступица для закрепления диска в станке
покрасочная
сушилка
Процесс:
— покупка листа стали 3мм
— покупка штамповок с разборки
— резка дисков, резка металла на необходимые полосы
— прокатка полос на валках
— торцовка половинок дисков и полосы
— состыковка и координация полосы с частями диска
— варка швов
— зачистка
— прокатка (если есть хотя бы малейшие отклонения)
— пескоструй
— покраска порошком
диски после проварки и зачистки
Разварки — Лада 2107, 1.5 л., 2004 года на DRIVE2
Свершилось, сварили мне таки разварки.
Давно я их хотел, в итоге нашел людей, которые за очень вменяемый ценник изготовили их за 2 дня, покрасили и привезли, я им просто отдал комплект своих штамповок.
Полный размер
Разварки жигули ваз 2107
Разварки я ставил в 2 этапа, этап первый:
Поехал я их ставить, при балансировке стало понятно, что диски сварены хорошо.
Проблемы начались, когда начали ставить их на машину.
Передние колеса в общем-то влезли, задевают только при полном вывороте, а вод задние…
Задние никак влазить не хотели, начались танцы с бубном:
Разварки жигули ваз 2107
Разварки жигули ваз 2107
Задние колеса с имеющимся занижением никак не хотели влазить, арки немного раскатали, но левая сторона скребла постоянно при движении. Когда останавливался на светофорах колесо дымило.
Хотя вид с занижением конечно радовал:
Полный размер
Разварки жигули ваз 2107
В итоге: 3 часа времени порачено, ездить так нельзя, уже пора ехать на лед… Выругался, снял разварки и решил, что потом когда-нибудь буду их устанавливать.
Этап второй:
Надо как-то разварки все-таки ставить, варианта два: резать крылья и ставить фендеры, либо поднимать машину. (спасибо жига чатику)
Как выяснилось, фендеры назад — это целое дело. Надо вырезать крылья, потом сварить крыло и подкрылок, при этом сняв бак и только потом ставить фендеры.
Вместе с m-alexandr взяли нива пружины, два Сашиных взмаха болгарской и пружины приняли нужную длину, на фото было-стало, но нивапружины еще не обрезаны, сняли с них 1,5 витка:
Полный размер
пружины ваз 2107
30 минут работы и разварки на месте.
Было:
Полный размер
Разварки жигули ваз 2107
Стало:
Полный размер
Разварки жигули ваз 2107
Немного фото:
Полный размер
Разварки жигули ваз 2107
Полный размер
Разварки жигули ваз 2107
Полный размер
Разварки жигули ваз 2107
Немного подожду, чтобы пружины чуть просели, если будет высоко, можно еще полвитка-виток пилануть
Делаем разварки сами — DRIVE2
Для начала определимся, что такое «разварки». Разварки — это стальной автомобильный диск с увеличенной шириной. Существует два способа увеличить ширину стального диска. Далее мы рассмотрим оба.
Способ 1
Разваривание диска методом «из двух штамповок». Соответственно, чтобы сделать одну разварку, нам понадобятся 2 стальных диска. Подготовка дисков. Желательно, чтобы они были ровные изначально. Идеально, если диски новые. Но чаще всего разварки изготавливаются из б/у дисков, так как использование новых значительно увеличивает конечную стоимость. Итак, у нас есть две штамповки (или 8, если говорить к комплекте). Первым делом нужно оценить их внешний вид и проверить насколько они ровные. Для этого зажимаем ступицу от автомобиля (на который вы делаете разварки) в тиски. Устанавливаем на нее диск и вращаем, фиксируя биение. Если нет отдельной ступицы, то можно одеть диск на ведущую ось автомобиля, включить первую передачу и оценить биение. Только в этом случае, чтобы авто не упало, нужно обязательно поставить подпорку вместо домкрата или «пирамидку», а под колеса положить кирпичи или бруски для предотвращения качения. Биение диска можно оценить двумя способами: на глаз (не точно, можно оценить только факт присутствия биения) и с помощью линейки. Линейкой можно измерить величину биения. Для этого прикладываем ее в двух плоскостях: горизонтальной и вертикальной (рис 1.) Если биение в пределах 1-2 мм — это нормально. Если более 2 мм в любой из плоскостей, то диск желательно прокатать на дископраве.
Далее из двух дисков выбираем более ровный, его будем использовать в качестве основы. Не лишним будет подписать его сразу, чтоб потом не запутаться, какие 4 из 8 служат основой. Второй диск будет ободом. После начинается резка. В идеале это делать на токарном станке. Но у кого нет такой возможности, можно отрезать и болгаркой. По своему опыту скажу, что редко у кого получается отрезать ровно с первого раза, но потом это не составит труда! Чтобы отрезать ровно, рисуем линию маркером или клеим толстый скотч (изоленту) и режем по краю скотча. Отрезаем наружный (маленький) обод от диска-основы как показано на рисунке 2. Второй диск режем, как как показано на рисунке 3. В итоге от второго диска остался внутренний обод, который будет наружным на диске-основе. Далее от него надо отрезать часть, которая осталась от диска рис. 4 Сделать это можно двумя способами: либо высверливаем дрелью точки сварки и сбиваем остальное зубилом, либо стачиваем болгаркой эти точки. После стыкуем две половинки будущей разварки (на глаз) и прихватывем тремя-четырьмя сварочными точками на равном расстоянии. Важно: не делать точки большими, чтобы потом можно было подправить центровку обода. Далее одеваем диск на ступицу и вращаем, оценивая биение. При необходимости подстукиваем молотком. После окончательно обвариваем диск. Чтобы диск не повело, варить начинаем с двух или трех равноудаленных точек на окружности распила. Варим от первой точки не сильно длинными стяжками (5-6см), потом переходим на вторую, на третью, и возвращаемся туда, где закончили на первой. И так далее, пока шов не замкнется в круг. Разварка готова! Да, не забудьте на новом широком ободе просверлить отверстие под сосок ( 11,5 мм)!
Способ 2
Изготовление методом вваривания полосы. Как сделать разварки методом вваривания полосы? Здесь нам понадобятся 4 штамповки и полосы металла нужной вам ширины и толщины. Для вазовских дисков хватит 2мм толщины. Для иномарок потолще надо брать. В общем, толщину полосы берем такую же как у диска. Для начала подготавливаем диски, как написано в способе 1. Тут не надо выбирать более ровный, надо, чтоб они все были ровные. Если нет — на дископрав. Далее режем диск как на рис.2. С помощью вот такого дивного приспособления делаем из полосы кольцо.
Привариваем отрезанный обод к кольцу 3-4 точками. Затем кольцо с ободом привариваем к диску также на точки. Далее все повторяется: на ступицу, крутим, подстукиваем молотком, обвариваем. Кстати, длину полосы можно легко посчитать по формуле: L=2Пr, где L — длина полосы, П — «пи»- 3,14, r — радиус окружности распила. Плюсом этого способа является то, что ширину диска можно сделать любую, в отличии от первого способа. Минус — этот способ сложнее, больше подгонки, и два сварочных шва, которые увеличивают шанс «ведения» металла в процессе сварки. Поэтому важно не варить сплошняком из одной точки!
После сварки диски можно свозить на дископрав, но это не обязательно и зависит от мастерства сварщика и желания заказчика! Также многие для прочности обваривают диск с «лицевой» стороны. Это стоит сделать, если шов внутри получился «не очень». Также плохо обработанный шов снаружи очень портит внешний вид.
Если вы собираетесь использовать бескамерные шины, то швы нужно загерметизировать. Для этого подойдет любой герметик. Но необходимо, чтобы на диске были хампы. В противном случае, ставим камеру. Лично я чаще использую камеру, так надежнее, да и «посадить» резину проще (особенно если она намного уже диска).
Изготовление разварок
Мы занимаемся изготовлением разварок и покраской дисков.
Пишите и звоните нам, вас всегда проконсультируют.
На главной странице вы найдете полезные статьи.
В статьях мы делимся опытом, отмечаем плюсы и минусы дисков, и их методов расширения.
ИЗГОТОВЛЕНИЕ РАЗВАРОК.
Разварка дисков методом вставки пластины из металла толщиной от 2 до 4 мм, шириной от 25мм до 100мм.
Тип расширения:
возможны их вариации
О плюсах и минусах типов расширения, можно прочесть в нашей статье Методы расширения стальных дисков.
Для изменения ЕТ (вылета) меняем обода местами либо увеличиваемым или уменьшаем ширину заднего обода.
Отметим, что значение вылета может иметь свои пределы, это зависит от самих дисков, а точнее их формы.
Цена работы от 1т.р. за 1 диск, конечная цена будет зависит от требуемых параметров и сложности работы.
Изготавливаем пластины/вставки для расширения диска, шириной от 25 до 120 мм, от 12-17 диаметра.
Используя наши пластины вы может изготовить разварки своими руками.
О изготовление разварок вы можете посмотреть материла в разделе Видео.
У нас вы можете приобрести новые штампованные диски для разварок.
Ассортимент дисков и цены указаны в разделе: Каталог.
-Процесс разварки дисков происходит на специальных станках, что позволяет изготавливать диски с минимально допустимой погрешностью.
-Стыки на лицевой стороне (полке) обрабатываются, после становятся практически не заметными, но из-за особенностей формы некоторых дисков стык после обработки может быть виден.
-Погрешность при изготовлении разварок допускается, радиальное и осевое биения в пределах 0,1-1 мм. Погрешность зависит от исходного состояние дисков.
-Сварка производиться полуавтоматом, тип используемого шва- нормальный, швы герметичные.
Гарантия на изделие 3 месяца.
БЕСПЛАТНЫЙ РЕМОНТ.
Наши клиенты не зависимо от срока использования разварок могут воспользоваться услугой ремонта дисков бесплатно.
Производим бесплатную правку до расширения дисов.
Пескоструйка — очистка металла от старой краски.
Покраска полимерными (порошковыми) красками, покрытие лаком.
Завихритель, разварки и прямоток. Чем опасен «гаражный» тюнинг? | Об автомобилях | Авто
Во многих гаражных массивах существуют свои негласные молодежные клубы по спортивному усовершенствованию автомобилей. Они работают по принципу минимальных затрат и для достижения визуального превосходства «улучшаемых» моделей используют крайне агрессивные методы. Всем памятны эксперименты с занижением подвески на автомобилях Lada. Но это лишь малая часть из стандартного арсенала начинающего тюнера. Какие же еще применяются методы и насколько они эффективны?
Разварки
Одним из главных элементов, помогающих придать машине спортивный вид, являются колеса. В гаражном тюнинге вместо дорогих кованых катков используются так называемые «разварки». Это широкие колеса, изготовленные на основе обычных штамповок путем расширения их за счет металлических вставок. Берутся два диска, разрезаются на токарном станке и затем свариваются. Из двух колес получается один каток, похожий на колеса из «Формулы-1» шириной 9, 10, 11 и даже 12 дюймов. Для колеса подбирается спортивная импортная низкопрофильная резина, которая не помещается в стандартные арки, из-за чего крылья приходится подрезать. Однако они действительно придают машине мужественный и энергичный вид.
Как считается, «разварки» придают автомобилю больше стабильности во время дрифта и улучшают управляемость. Кроме того, они лучше ведут себя на плохой дороге. Однако на этом достоинства самодельных колес заканчиваются.Главный недостаток «разварок» в том, что они запрещены. Подобная модернизация автомобиля не допускается Техническим регламентом Таможенного союза, а также Правилами дорожного движения. Запрет обоснован ненадежностью сварного шва, который может при ударах потерять герметичность. Шина мгновенно теряет давление, из-за чего управляемость резко снижается.
Есть проблемы и с шиномонтажом. Установить резину на широкий каток непросто. Но главное, что динамика машины на «разварках» снижается. Колеса и диски заметно утяжеляют тюнингованную подвеску, растет нагрузка на ступичные подшипники, шаровые опоры, рычаги и сайлентблоки. Порой из-за веса и выросшего сопротивления потребление бензина поднимается примерно на 15-20%.
«Завихрители»
Для увеличения мощности мотора некоторые мастера пытаются применять так называемые «завихрители». Это вставки для системы впуска, которые, как считается, имитируют принцип работы турбонаддува. Данный элемент тюнинга встречается в двух исполнениях, а именно в виде крыльчатки с загнутыми вовнутрь лопатками, похожими на лопасти турбины, и в виде стационарного пропеллера. Некоторые умельцы даже вырезают подобные лопасти из консервной банки. Считается, что завихрители помогают раскрутить поток воздуха и тем самым увеличить давление во впуске и улучшить поступление кислорода в камеры сгорания.
В теории вихревой поток действительно улучшает смешивание бензовоздушной смеси и обеспечивает равномерное сгорание в цилиндрах. Таким образом, растет мощность силового агрегата.
Между тем на практике эффект от такого приспособления в лучшем случае нулевой, а чаще всего — отрицательный. Как правило, вихревой поток разрушается дроссельной заслонкой и теряет интенсивность при прохождении к мотору. При расположении завихрителя перед фильтром турбулентность полностью нивелируется ячейками фильтрующего материала.
Более того, «лопасти» завихрителя закрывают часть системы впуска, препятствуют прохождению воздуха, возникает антидавление, снижающее насыщение горючей смеси кислородом. Она хуже горит, отчего теплоотдача снижается и мощность мотора падает.Кроме того, пары недогоревшего бензина выбрасываются в систему выпуска, образуются сажевые отложения, забиваются клапаны и поршни. Несколько месяцев езды с таким «усоврешенствованием» иногда приводят к необходимости капитального ремонта силового агрегата.
Прямоток
Еще один способ увеличить мощность мотора — это убрать все препятствия для отвода выхлопных газов. Одним из самых простых и относительно бюджетных решений считается установка спортивных труб и глушителя.
В штатных заводских глушителях компенсация звука в выхлопной системе осуществляется при помощи системы камер и отражателей, которые преломляют и рассеивают звуковые волны. Однако торможение газов вызывает противодавление и затруднение оттока газов, за счет чего мощность мотора снижается на 5-10%.
Звук в спортивном глушителе гасится совершенно другим способом. Прямоточный выхлоп состоит из сквозной банки, где стоят перфорированная труба и термостабильный материал, поглощающий звук. Такой глушитель гораздо громче обычного, но он позволяет повысить мощность примерно на 3-5%. Кроме того, он не запрещен законодательством. ГИБДД охотно рассматривает возможность его установки и при соответствии техническим требованиям дает разрешение.
Однако установка прямотока бессмысленна в машинах с экологическим классом выше Евро-3. В них стоит каталитический нейтрализатор, который полностью перекрывает отход газов от мотора и фиксирует давление оттока. Какой бы глушитель ни стоял позади катализатора, отток газов остается стабильным. А удаление катализатора запрещено законодательством. Без него невозможно получить диагностическую карту.
Корса на разварках – BODYBEAT
Тема разварок в нашей стране только набирает обороты, в то время как во всем мире она просто существут уже очень давно. Сейчас все любят машины с хэлафлашем и лежащие на пузе – это круто. Тем не менее есть много машин на кажды день из мест где плохие дороги либо какие-то еще соображения мешающие лежать уж совсем на пузе. Там тоже есть на что посмотреть.
Перед нами Опель Корса, а точнее Воксхол (VAUXHALL) Корса – потому что в Британии их так любят называть. Дело привычки. Для нас это все-таки Опель, ну а кому то это может и похожим на Ладу Калину показаться. Машина эта переработана с головы до колес.
Сказать что колеса в первую очередь привлекают внимание к этой машине может быть лукавством. Эти разварки – как вишенка на хорошем куске торта. Выкрашены очень кстати – название цвета центра дисков карамельно-вишневый. Белые обода удачно контрастируют с резиной, выпирая за ее край.
Спереди стоят 15х8j, сзади 15х9j. На них натянута резина Hankook 195/45/15. В остальном этот автомобиль тоже далеко не прост. Задние стекла заварены и выведены под кузов. Передние арки приделаны от Астры, от которой таже сюда перекочевали и передние тормоза. Регулируемая подвеска Spax RSX занижена примерно на 90мм сзади и 80мм спереди. Сухие цифры для обывателя могут казаться большими, но взгляните на арки и гэп до колес. Мне кажется можно было бы убрать еще 30-50мм. Но и так как есть смотрится шикарно и явно уберегает владельца от долгого выбора пути до дома.
Пытливый взор тут увидит еще и обвес. Мне очень нравятся бамперы интегрированные с остальным кузовом. Разглядывая эти детали замечаешь, что шейвинг кузова тут проведен просто капитальный. При этом интересно смотрится боковой выхлоп выведенный сквозь порог.
Спасибо SpeedHunters
This entry was posted by Михаил Жуков in Лента and tagged Opel, vauxhall, колеса, кузов, подвеска, разварка, разварки.Разварка дисков — для чего нужна и какие недостатки имеет — Рамблер/авто
Колесные диски — это элементы, которые влияют на многие технические показатели в автомобиле. Кроме того, они могут кардинально изменить внешний вид транспортного средства и выделить его среди общего потока. Именно поэтому, при тюнинге самый первый акцент делается на эти элементы.
Сегодня в автомобильной сфере есть колеса разварки, которые представляют из себя расширенный штампованный диск. При помощи такого элемента можно поставить более широкие покрышки, что положительно сказывается при дрифте, и сделать все колесо визуально шире. С первого взгляда может показаться, что это очень простое и недорогое решение. Однако, разварки имеют не только преимущества, но и некоторые недостатки.
Разварки на автомобиле — для чего нужны. Сегодня на автомобильном рынке можно встретить очень большой ассортимент колесных дисков. Кроме классических штамповок, можно найти литые и кованые элементы. При этом, может различаться размер и исполнение. Однако, многие автовладельцы не совсем довольны готовыми деталями, поэтому обращают свое внимание на разварку дисков. Это особый способ доработки колеса, который применяют в автоспорте. Сегодня на дорогах можно увидеть автомобили ВАЗ на разварках и даже иномарки. Для чего же ставят такие элементы?
С самого начала разварки ставили для того, чтобы улучшить устойчивость и сцепку на дороге;
Иногда такое оборудование можно встретить на автомобилях из спортивного мира, так как разварки помогают улучшать устойчивость во время выполнения маневров;
Такое же решение можно встретить на машинах, которые прошли тюнинг — автомобиль выглядит более спортивно и даже агрессивно.
Виды и особенности. Сегодня выделяется 2 типа разварки — заводская и изготовленная своими руками. Первый вариант считается самым оптимальным. Однако, такой вид нельзя назвать разваркой, так как их изготавливают на заводе изначально в виде спортивных. Главным недостатком такого типа можно считать лишь то, что в магазине не такой широкий ассортимент. Кроме того, подобные изделия отличаются высокой стоимостью. Если говорить о собственноручном изготовлении, можно выделять разварку:
созданную при помощи двух классических дисков;
созданную при помощи металлической полосы.
Разварка своими руками. Самый простой способ — сварить друг с другом два диска. Основной процесс, при этом, заключается в разрезании дисков и склеивании их друг с другом. Основной недостаток такого способа — для изготовления одного диска требуется сразу 2 стандартных. То есть, чтобы разварить 4 диска, нужно изначально иметь 8 классических. Второй способ заключается в интеграции металлической полосы для расширения диска. Этот вариант более дешевый, но занимает больше времени и требует наличия определенных навыков. Вся сложность заключается в долгом подборе конкретного металла, вырезании полосы и придания ей правильной формы. И это далеко не все, ведь больше времени уходит на правильную сварку. Перед этим нужно порезать основной диск пополам, а по центру вварить изготовленный элемент.
Недостатки. Главный недостаток заключается в необходимости подрезания колесных арок. Если устанавливать такие элементы на автомобили ВАЗа, то никаких вопросов возникать не должно. Если же брать более дорогие машины и колеса, то можно задуматься о целесообразности. Ведь в случае некачественной работы можно лишиться арки. Лучше всего такой элемент будет смотреться на автомобилях с низкой посадкой. Ни для кого не секрет, что сильное занижение не подойдет для комфортной эксплуатации на дорогах России. Такой вариант лучше подойдет для дрифт-машины, но не для гражданской.
Еще один важный недостаток установки разварок заключается в том, что возрастает нагрузка на многие элементы автомобиля — трансмиссия, мотор, кузов, подвеска и рулевое управление. Диски разварки весят очень много, тем самым перегружают ступицу. Разваренные диски могут получать трещины в различных местах, особенно там, где проходит шов. Обслуживать автомобиль с таким дополнением смогут не в каждом сервисе, так как с первыми проблемами сталкиваются уже при снятии колеса, не говоря уже о накачивании шин. Пожалуй, самый существенный минус состоит в том, что такой автомобиль не пройдет техосмотр, кроме того, его нельзя использовать на общих дорогах. Поэтому перед прохождением очередного ТО машину нужно будет переобуть.
Итог. Диски разварки сегодня ставят на многие автомобили. Некоторые делают это для того, чтобы украсить автомобиль и выделить его среди общего потока. Однако, большинство подобных ТС встречается в мире спортивных авто.
Поговорим немного о разварках? — MyTypeR Talk
Все, что касается железа: доработки подвески, двс, турбо и прочее.
- Cybam (Автор темы)
- Сообщения: 118
- Зарегистрирован: 07 дек 2016
- Откуда: Воронеж
Сообщение Cybam »
Сегодня увидел на Хендай Купе хромированные разварки. Хочу сказать, что как бы плохо я к ним не относился, но мне понравились. Ясное дело, что Хендай Купе сравнивать с Тайпером как-то совсем негоже, но все же машина тоже неплохая. Раньше думал, что только на Приоры и им подобные автомобили ставят разварки, но ошибся. Смотрелись действительно хорошо. И вот подумал я, а как воспримут владельцы Тайперов такой вид тюнинга?
Cybam
- DimaN
- Сообщения: 57
- Зарегистрирован: 22 янв 2017
Сообщение DimaN »
Ну давай поговорим:)Cybam писал(а):Поговорим немного о разварках?
Я к разваркам отношусь совсем плохо, я их просто не воспринимаю. Расцениваю это как определенного рода колхозный вариант. Есть широкие литые диски. Можно их купить и поставить. Разварки — это эконом-вариант таких дисков.
Но как-то смотрел дрифт на разварках, да, зрелище прикольное, но опять же можно поставить широкое литье и будет значительно прикольнее.
DimaN
- woma
- Сообщения: 75
- Зарегистрирован: 09 янв 2017
Сообщение woma »
Cybam, написал бы еще, что видел сегодня, как мимо проезжала жига на разварках, заценил типа, и почему бы такие разварки не поставить на топор?! Вообще не понимаю эти разварки, даже не то что не понимаю, а не воспринимаю их.!
woma
- Alex
- Администратор
- Сообщения: 3137
- Зарегистрирован: 24 фев 2011
- Откуда: Москва
Сообщение Alex »
Лично мне нравятся, как смотрятся разварки на машине, если конечно машина соответствует подобным тапкам. Встречал редко и обычно на Stance и Hellaflush проектах. Плюс разварок в том, что можно сделать здоровенную полку, а не искать долго и кропотливо диски с необходимым вылетом. И абсолютно глупо думать, что цена разварок низкая. Качественные разварки стоят приличных денег и изготавливаются как правильно под проект.Alex
- Artem
- Сообщения: 58
- Зарегистрирован: 04 мар 2017
Сообщение Artem »
Нормальные разварки стоят нормальных денег. Если заказывать у какого-то гаражного мастера, тогда игра не стоит свеч. Качество таких разварок и их надежность будет ниже требуемого уровня. Если же заказывать качественные разварки, то почему бы и нет? Тем более, что действительно можно заказать с нужным вылетом.
Не понимаю такого скептического отношения к ним!
Artem
- Swarog
- Сообщения: 73
- Зарегистрирован: 16 дек 2016
Сообщение Swarog »
Alex, привет!На фотках разварки смотрятся очень даже неплохо.
Я не могу сказать, что отношусь к ним хорошо, но соглашусь с тем, что проще заказать разварки, чем искать диски нужной ширины, с нужным вылетом и пр.
Некоторые «гаражные кулибины» делают не хуже серьезных фирм. Только таких еще нужно найти!Artem писал(а):заказывать у какого-то гаражного мастера
Swarog
- Чубака
- Гуру мануалов
- Сообщения: 1657
- Зарегистрирован: 12 авг 2012
Сообщение Чубака »
Ребят, я вам стажу даже больше, разварки в 99% случаев делаются в гаражах. Это изначально гаражный тюнинг и стайлинг. Сейчас он входит в массы, поэтому какие-то производители конечно начали штамповать разварки на заводах. Но опять же, если нужны разварки под определенные параметры, вылет, разболтовку, то куда проце найти пряморукого мастера, чем искать готовое решение за адекватные деньги.
Чубака
- Artem
- Сообщения: 58
- Зарегистрирован: 04 мар 2017
Сообщение Artem »
Вот именно!Swarog писал(а):Некоторые «гаражные кулибины» делают не хуже серьезных фирм. Только таких еще нужно найти!
Встречал я таких, которые только начинают заниматься разварками, то есть изготавливать их, а уже понтов выше крыши. А качество ужасное. Сложно найти нормальных изготовителей. Но можно их по рекомендациям искать.
Совершенно верно, тут и не поспоришь. Только вопрос в том, где этого пряморукого мастера искать ? только по рекомендациям!Чубака писал(а):куда проце найти пряморукого мастера, чем искать готовое решение за адекватные деньги.
Artem
Вернуться в «Тюнинг»
Все готово к заселению: когда в России появится организм-на-чипе
https://ria.ru/20220223/chip-1774124808.html
Все готово к заселению: когда в России появится организм-на-чипе
Все готово к заселению: когда в России появится организм-на-чипе — РИА Новости, 23.02.2022
Все готово к заселению: когда в России появится организм-на-чипе
Организм-на-чипе — одна из самых передовых концепций в биотехнологии, в перспективе позволяющая перейти к персонализированной медицине. Исследования в этой… РИА Новости, 23.02.2022
2022-02-23T08:00
2022-02-23T08:00
2022-02-23T11:54
наука
биология
здоровье
чипы
мгту имени баумана
москва
/html/head/meta[@name=’og:title’]/@content
/html/head/meta[@name=’og:description’]/@content
https://cdnn21.img.ria.ru/images/07e6/01/18/1769229312_0:0:3072:1728_1920x0_80_0_0_ba0e9a405353f467821e7a51a2679907.jpg
МОСКВА, 23 фев — РИА Новости, Алексей Огнев. Организм-на-чипе — одна из самых передовых концепций в биотехнологии, в перспективе позволяющая перейти к персонализированной медицине. Исследования в этой области активно ведут в России. Корреспондент РИА Новости поговорил с инженерами из МГТУ имени Баумана, работающими над созданием мозга-на-чипе.Анатомический театр XXI векаИспытания лекарств — сложный и дорогостоящий процесс. Например, в 2019-м фармацевтические компании США потратили на это более 83 миллиардов долларов. Причем по статистике лишь 14 процентов протестированных препаратов получают одобрение американского Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA).Перспективные препараты тестируют сначала на культурах клеток, затем — на животных. По некоторым оценкам, их требуется для этого почти 200 миллионов в год. Потом — несколько этапов клинических испытаний. И все равно то или иное лекарство может не подойти конкретному пациенту.Все идет к персонализированной медицине. Тестировать препараты ученые предлагают на моделях организма человека. Берут клетки пациента, создают прообраз его мозга, сердца, печени в миниатюре и проверяют, годится ли ему лекарство. Звучит фантастически, однако такая технология уже существует. Это называется «орган-на-чипе» или «организм-на-чипе».В ячейки на чипе размером со смартфон поселяют живые клетки. Микроканалы позволяют смоделировать кровоток или обмен тканевыми жидкостями — например, лимфой. Все это помещают в специальную камеру, в которой поддерживают определенную температуру и газовый состав, прокачивают через чип питательные растворы, удаляют продукты метаболизма из ячеек.Идея принадлежит Дональду Ингберу, основателю и директору Института биологической инженерии имени Уисса при Гарвардском университете. В 2010-м он с коллегами создал первое устройство такого рода — легкое-на-чипе. Его пронизывали двухуровневые каналы, разделенные пористой мембраной. Один отдел содержал слой клеток легкого и был заполнен воздухом, другой — слой клеток кровеносного сосуда, где циркулировала кровь. По микроканалам можно было подводить вредоносные бактерии или молекулы лекарства и отслеживать, что происходит.Уже есть чипы, имитирующие работу почки, печени, кишечника, сердца. На очереди — мозг. Его защищает гематоэнцефалический барьер, сквозь который не проникают многие лекарства. Новая технология поможет определить, насколько эффективен в такой ситуации тот или иной препарат.В перспективе ученые хотят создать целый организм-на-чипе, воспроизводящий систему всех жизненно важных органов. К примеру, в американском агентстве DARPA уже собрали на одном устройстве десять микрофизиологических моделей.Российская лаборатория-на-чипеВ России прорывную технологию успешно развивают в научно-образовательном центре «Функциональные микро/наносистемы» (НОЦ ФМН) МГТУ имени Н. Э. Баумана. За пять лет появилось несколько ноу-хау, позволивших делать чипы из кремния, полимера и стекла, а также изготавливать микрофлюидные сенсоры потока жидкости.»Представьте себе миниатюрный нагреватель, который рассеивает очень мало (меньше 100 милливатт) тепла. Вы подаете жидкость в микроканал. Естественно, жидкость уносит тепло. Рядом с таким нагревателем прямо в микроканале с двух сторон устанавливают сенсоры температуры. Теперь мы знаем, в каком направлении движется тепло и с какой скоростью. Сейчас точность — не хуже 92 процентов, результат на мировом уровне. А учитывая, что все технологии заимствованы из микроэлектроники, устройство легко масштабируется для многоканальных лабораторий-на-чипе и организмов-на-чипе», — рассказывает директор НОЦ Илья Родионов.Инженеры разработали чипы со сложными схемами микроканалов и целую серию различных биосенсоров, в основном оптических, анализирующих излучение, чтобы определять даже очень малые концентрации различных биологических объектов. Следующий шаг — чип из стойких к агрессивным средам материалов для работы с бактериями и вирусами. Эффективность нового метода, не имеющего сегодня микрофлюидных аналогов в мире, превышает 80 процентов.Мозг-на-чипеРоссийские ученые взялись и за создание мозга-на-чипе. Тут не обойтись без междисциплинарного взаимодействия, реализуемого сегодня в рамках федеральной программы «Приоритет-2030» и стратегического проекта Bauman DeepTech. Сотрудники научно-образовательного центра уже наладили контакт с факультетом “Биомедицинская техника” МГТУ, а также Научным центром неврологии.“Биологи умеют растить клеточные культуры, а мы — делать чипы. Мы очень удачно дополняем друг друга”, — уверен Виталий Рыжков, ведущий исследователь НОЦ по направлению «Бионанотехнологии и микрофлюидика».Вначале нужно заселить на чип клетки мозга и организовать их взаимодействие.“Нужно пять-семь биореакторов, где выращивают клетки, характерные для того или иного отдела человеческого мозга. Дальше необходимо создать микрофлюидную систему с мембранной структурой, чтобы подвести питающие вещества, как это у нас происходит в голове через кровь. Мы свяжем эти биореакторы очень тонкими каналами, имитирующими капиллярную систему. Это откроет дорогу пионерским исследованиям”, — отмечает Илья Родионов.Даже если смоделировать работу одной структуры человеческого мозга, например гематоэнцефалического барьера, уже можно изучить процессы обмена веществ в этой структуре, как она участвует в метаболизме и видоизменении.“На станциях водоочистки для оценки качества воды используют раков, которые, как известно, предпочитают водоемы с очень чистой водой. Если они не приживаются, значит, надо принимать меры. В лаборатории-на-чипе тот же принцип, только вместо раков — живые клетки человека”, — объясняет Виталий Рыжков.Клетки мозга можно получить с помощью биопсии или аутопсии, а также вырастить из стволовых клеток. Однако предстоит решить ряд проблем.»Например, мы вырастили шарики размером 20 на 20 микрон из клеток мозга, так называемые органоиды. Они живут, пока омываются раствором, который подводит питательные вещества и удаляет продукты метаболизма. Но когда органоиды увеличиваются до 50 на 50 микрон, клетки глубоко внутри не получают питание и отравляют окружающие клетки токсинами», — уточняет исследователь.В НОЦ ФМН разработали технологии изготовления жестких и эластичных микрофлюидных чипов, готовых для заселения живыми клетками. Ближайшие два-три года уйдут на моделирование либо гематоэнцефалического, либо гематоликворного барьера, который гораздо менее изучен (он отделяет спинномозговую жидкость от крови).Сейчас сложно оценить, насколько эффективен будет поиск лекарств с помощью организма-на-чипе, потому что таких систем пока не существует. Однако через десять лет они появятся.
https://ria.ru/20170216/1488119074.html
москва
РИА Новости
7 495 645-6601
ФГУП МИА «Россия сегодня»
https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/
2022
Татьяна Пичугина
Татьяна Пичугина
Новости
ru-RU
https://ria.ru/docs/about/copyright.html
https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/
РИА Новости
7 495 645-6601
ФГУП МИА «Россия сегодня»
https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/
https://cdnn21.img.ria.ru/images/07e6/01/18/1769229312_243:0:2974:2048_1920x0_80_0_0_323c65ae268572404b8dd4829ce075c7.jpgРИА Новости
7 495 645-6601
ФГУП МИА «Россия сегодня»
https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/
Татьяна Пичугина
биология, здоровье, чипы, мгту имени баумана, москва
МОСКВА, 23 фев — РИА Новости, Алексей Огнев. Организм-на-чипе — одна из самых передовых концепций в биотехнологии, в перспективе позволяющая перейти к персонализированной медицине. Исследования в этой области активно ведут в России. Корреспондент РИА Новости поговорил с инженерами из МГТУ имени Баумана, работающими над созданием мозга-на-чипе.
Анатомический театр XXI века
Испытания лекарств — сложный и дорогостоящий процесс. Например, в 2019-м фармацевтические компании США потратили на это более 83 миллиардов долларов. Причем по статистике лишь 14 процентов протестированных препаратов получают одобрение американского Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA).Перспективные препараты тестируют сначала на культурах клеток, затем — на животных. По некоторым оценкам, их требуется для этого почти 200 миллионов в год. Потом — несколько этапов клинических испытаний. И все равно то или иное лекарство может не подойти конкретному пациенту.Все идет к персонализированной медицине. Тестировать препараты ученые предлагают на моделях организма человека. Берут клетки пациента, создают прообраз его мозга, сердца, печени в миниатюре и проверяют, годится ли ему лекарство. Звучит фантастически, однако такая технология уже существует. Это называется «орган-на-чипе» или «организм-на-чипе».
В ячейки на чипе размером со смартфон поселяют живые клетки. Микроканалы позволяют смоделировать кровоток или обмен тканевыми жидкостями — например, лимфой. Все это помещают в специальную камеру, в которой поддерживают определенную температуру и газовый состав, прокачивают через чип питательные растворы, удаляют продукты метаболизма из ячеек.
Идея принадлежит Дональду Ингберу, основателю и директору Института биологической инженерии имени Уисса при Гарвардском университете. В 2010-м он с коллегами создал первое устройство такого рода — легкое-на-чипе. Его пронизывали двухуровневые каналы, разделенные пористой мембраной. Один отдел содержал слой клеток легкого и был заполнен воздухом, другой — слой клеток кровеносного сосуда, где циркулировала кровь. По микроканалам можно было подводить вредоносные бактерии или молекулы лекарства и отслеживать, что происходит.Уже есть чипы, имитирующие работу почки, печени, кишечника, сердца. На очереди — мозг. Его защищает гематоэнцефалический барьер, сквозь который не проникают многие лекарства. Новая технология поможет определить, насколько эффективен в такой ситуации тот или иной препарат.
В перспективе ученые хотят создать целый организм-на-чипе, воспроизводящий систему всех жизненно важных органов. К примеру, в американском агентстве DARPA уже собрали на одном устройстве десять микрофизиологических моделей.16 февраля 2017, 14:20НаукаБиологи из России ускорили анализ содержимого клеток в 30 тысяч разРоссийская лаборатория-на-чипе
В России прорывную технологию успешно развивают в научно-образовательном центре «Функциональные микро/наносистемы» (НОЦ ФМН) МГТУ имени Н. Э. Баумана. За пять лет появилось несколько ноу-хау, позволивших делать чипы из кремния, полимера и стекла, а также изготавливать микрофлюидные сенсоры потока жидкости.«Представьте себе миниатюрный нагреватель, который рассеивает очень мало (меньше 100 милливатт) тепла. Вы подаете жидкость в микроканал. Естественно, жидкость уносит тепло. Рядом с таким нагревателем прямо в микроканале с двух сторон устанавливают сенсоры температуры. Теперь мы знаем, в каком направлении движется тепло и с какой скоростью. Сейчас точность — не хуже 92 процентов, результат на мировом уровне. А учитывая, что все технологии заимствованы из микроэлектроники, устройство легко масштабируется для многоканальных лабораторий-на-чипе и организмов-на-чипе», — рассказывает директор НОЦ Илья Родионов.
Инженеры разработали чипы со сложными схемами микроканалов и целую серию различных биосенсоров, в основном оптических, анализирующих излучение, чтобы определять даже очень малые концентрации различных биологических объектов. Следующий шаг — чип из стойких к агрессивным средам материалов для работы с бактериями и вирусами. Эффективность нового метода, не имеющего сегодня микрофлюидных аналогов в мире, превышает 80 процентов.© НОЦ Функциональные Микро/Наносистемы МГТУ им. Н.Э. БауманаПластина с массивом микрофлюидных чипов
1 из 4
Пластина с массивом микрофлюидных чипов
© НОЦ Функциональные Микро/Наносистемы МГТУ им. Н.Э. БауманаМикрофлюидный чип после разделения пластины
2 из 4
Микрофлюидный чип после разделения пластины
© НОЦ Функциональные Микро/Наносистемы МГТУ им. Н.Э. БауманаБиосовместимый микрофлюидный чип в процессе УЗ-разварки на печатную плату
3 из 4
Биосовместимый микрофлюидный чип в процессе УЗ-разварки на печатную плату
© НОЦ Функциональные Микро/Наносистемы МГТУ им. Н.Э. БауманаБиосовместимый микрофлюидный чип во время измерения и калибровки
4 из 4
Биосовместимый микрофлюидный чип во время измерения и калибровки
1 из 4
Пластина с массивом микрофлюидных чипов
2 из 4
Микрофлюидный чип после разделения пластины
3 из 4
Биосовместимый микрофлюидный чип в процессе УЗ-разварки на печатную плату
4 из 4
Биосовместимый микрофлюидный чип во время измерения и калибровки
Мозг-на-чипе
Российские ученые взялись и за создание мозга-на-чипе. Тут не обойтись без междисциплинарного взаимодействия, реализуемого сегодня в рамках федеральной программы «Приоритет-2030» и стратегического проекта Bauman DeepTech. Сотрудники научно-образовательного центра уже наладили контакт с факультетом “Биомедицинская техника” МГТУ, а также Научным центром неврологии.
“Биологи умеют растить клеточные культуры, а мы — делать чипы. Мы очень удачно дополняем друг друга”, — уверен Виталий Рыжков, ведущий исследователь НОЦ по направлению «Бионанотехнологии и микрофлюидика».
Вначале нужно заселить на чип клетки мозга и организовать их взаимодействие.
“Нужно пять-семь биореакторов, где выращивают клетки, характерные для того или иного отдела человеческого мозга. Дальше необходимо создать микрофлюидную систему с мембранной структурой, чтобы подвести питающие вещества, как это у нас происходит в голове через кровь. Мы свяжем эти биореакторы очень тонкими каналами, имитирующими капиллярную систему. Это откроет дорогу пионерским исследованиям”, — отмечает Илья Родионов.
Даже если смоделировать работу одной структуры человеческого мозга, например гематоэнцефалического барьера, уже можно изучить процессы обмена веществ в этой структуре, как она участвует в метаболизме и видоизменении.
“На станциях водоочистки для оценки качества воды используют раков, которые, как известно, предпочитают водоемы с очень чистой водой. Если они не приживаются, значит, надо принимать меры. В лаборатории-на-чипе тот же принцип, только вместо раков — живые клетки человека”, — объясняет Виталий Рыжков.
1 из 5
Здесь формируют тонкопленочные покрытия для микрофлюидных устройств. НОЦ «Функциональные микро/наносистемы» МГТУ имени Н. Э. Баумана.
2 из 5
Директор НОЦ ФМН Илья Родионов.
3 из 5
Ведущий исследователь по направлению бионанотехнологии научного центра «Функциональные микро/наносистемы» МГТУ имени Н.Э. Баумана Виталий Рыжков.
4 из 5
Работы с гелиевым ионным нанофабом.
5 из 5
Пластина с микрофлюидными чипами для биологических экспериментов.
1 из 5
Здесь формируют тонкопленочные покрытия для микрофлюидных устройств. НОЦ «Функциональные микро/наносистемы» МГТУ имени Н. Э. Баумана.
2 из 5
Директор НОЦ ФМН Илья Родионов.
3 из 5
Ведущий исследователь по направлению бионанотехнологии научного центра «Функциональные микро/наносистемы» МГТУ имени Н.Э. Баумана Виталий Рыжков.
4 из 5
Работы с гелиевым ионным нанофабом.
5 из 5
Пластина с микрофлюидными чипами для биологических экспериментов.
Клетки мозга можно получить с помощью биопсии или аутопсии, а также вырастить из стволовых клеток. Однако предстоит решить ряд проблем.
«Например, мы вырастили шарики размером 20 на 20 микрон из клеток мозга, так называемые органоиды. Они живут, пока омываются раствором, который подводит питательные вещества и удаляет продукты метаболизма. Но когда органоиды увеличиваются до 50 на 50 микрон, клетки глубоко внутри не получают питание и отравляют окружающие клетки токсинами», — уточняет исследователь.
В НОЦ ФМН разработали технологии изготовления жестких и эластичных микрофлюидных чипов, готовых для заселения живыми клетками. Ближайшие два-три года уйдут на моделирование либо гематоэнцефалического, либо гематоликворного барьера, который гораздо менее изучен (он отделяет спинномозговую жидкость от крови).
Сейчас сложно оценить, насколько эффективен будет поиск лекарств с помощью организма-на-чипе, потому что таких систем пока не существует. Однако через десять лет они появятся.
Крупномасштабное ремоделирование репрессированного экзона рибонуклеопротеина в комплекс определения экзона, активный для сплайсинга
Ранние экзонные RNP-комплексы, собранные на РНК дикого типа и мутантных экзонов, имеют равные количества связанных U1 и U2AF и кажутся сходными по подвижности в геле, но различаются по своей способности к дальнейшей сборке в EDC. Для количественного сравнения их состава использовали SILAC-масс-спектрометрию (мечение стабильными изотопами аминокислотами в культуре клеток). Клетки HeLa S3 культивировали либо в стандартной среде 12 C с аминокислотами, либо в среде 13 C-аргинин и 13 C-лизин-замещенной среде (фиг. 4A).Из этих легких ( 12 С) или тяжелых ( 13 С) культур готовили ядерные экстракты, которые использовали для сборки экзонных комплексов. РНК дикого типа инкубировали в тяжелом ядерном экстракте с образованием репрессированного комплекса, а мутантную РНК инкубировали в легком экстракте с образованием активного раннего комплекса и EDC. Экзонные RNP-комплексы очищали, как описано выше, а затем тяжелый репрессированный комплекс и легкий активный ранний комплекс смешивали в молярном соотношении 1:1 в расчете на количество экзонной РНК.Смешанные комплексы подвергали расщеплению трипсином и анализу ЖХ-МС-МС для всесторонней идентификации их компонентов. Каждый трипсинизированный пептид определяли как два пика, полученных от 12 C или 13 C, замещенных лизином или аргинином (фиг. 4A). Отношение SILAC (легкий к тяжелому) рассчитывали по интенсивностям этих двух пиков, чтобы обеспечить меру относительной представленности каждого белка в двух комплексах. Средние отношения SILAC белков комплекса связывания Cap, CBP20 и CBP80, которые в равной степени связываются со всеми экзонными RNP-комплексами, использовали для нормализации соотношений SILAC других белков и устранения ошибок, возникающих в результате неравного смешивания и обработки образцов двух комплексов.
Дистальное связывание PTBP1 вызывает резкие изменения состава экзонных комплексов.
( A ) Схема эксперимента SILAC-MS. Экзоны WT и MUT N1, меченные MS2, использовали для сборки экзонных комплексов с тяжелым (красный) и легким (зеленый) ядерными экстрактами соответственно. Тяжелые репрессированные и легкие активные ранние комплексы очищали, как показано на рисунке 3А, а затем смешивали в молярном соотношении 1:1 и подвергали МС-анализу.( B ) Относительное содержание белков в активном раннем комплексе по сравнению с подавленным. Левая панель: тепловая карта, показывающая изменения кратности отдельных белков, обнаруженных в обоих комплексах. Изменения кратности рассчитывали путем деления нормализованного соотношения SILAC в активном комплексе на соотношение SILAC в репрессированном комплексе. Показана цветовая шкала для шкалы изменения кратности. Белки, обогащенные активным ранним комплексом, выделены зеленым цветом; белки, обогащенные репрессированным комплексом, отмечены красным цветом, а белки, в равной степени присутствующие в двух комплексах, отмечены желтым цветом.Белки со значительными изменениями кратности отмечены слева (синий: белки SR; оранжевый: белки U2 snRNP). Правая панель: Иммуноблот представляющих интерес белков в репрессированных и активных ранних комплексах. CBP80 использовали в качестве контроля загрузки. Верхний индекс «E» указывает на обнаружение ECL (усиленная хемилюминесценция), а «F» указывает на флуоресцентные вторичные антитела. Обратите внимание, что изменения в интенсивности полосы, наблюдаемые с помощью ECL, менее количественные, чем для флуоресценции. ECL использовали для увеличения сигнала менее эффективных антител.( C ) Относительное содержание белков в EDC по сравнению с активным ранним комплексом. Левая панель: тепловая карта, показывающая кратность изменения отдельных белков, обнаруженных в обоих комплексах. Цветовая шкала ниже. Белки помечены слева, как в ( B ). Правая панель: Иммуноблот представляющих интерес белков в EDC и активных ранних комплексах. Значения NSAF для всех белков приведены в дополнительном файле 1.
https://doi.org/10.7554/eLife.19743.008Многие белки имели отношения SILAC, близкие к 1, что указывает на равное связывание в репрессированных и активных ранних комплексах.Как и ожидалось, они включали белки, специфичные для U1, U1A, U1C и U1-70K. U2AF65 и U2AF35 демонстрировали несколько более высокие уровни в активном комплексе ранних экзонов, возможно, из-за стабилизации их связывания другими факторами, поскольку этот экзон далее собирается в комплекс, активный для сплайсинга (рис. 4В). Из белков, проявляющих большие различия в связывании между двумя комплексами, только три показали более чем двукратное обогащение репрессированным комплексом. Это были ожидаемый PTBP1 и два белка, которые, как известно, являются корепрессорами PTBP1 при репрессии других экзонов, RAVER1 и MBNL1 (рис. 4B, правая панель; дополнительный файл 1) (Joshi et al., 2011; Громак и др., 2003; Гудинг и др., 2013). Другой известный белок, взаимодействующий с PTBP1, MATRIN3, непостоянно обнаруживается в комплексах экзонов (Coelho et al., 2015).
Многие белки демонстрируют противоположный характер связывания по сравнению с PTBP1, MBNL1 и RAVER1, с повышенным связыванием в активном раннем комплексе по сравнению с репрессированным комплексом. Большое увеличение наблюдалось в нескольких белках hnRNP, включая C, D, G (RBMX), K, R, Q (SYNCRIP) и U (рис. 4B; дополнительный файл 1). HnRNP A1 и H, которые, как ранее было показано, связываются с экзоном N1 и ниже по течению, существенно не изменились между двумя комплексами (Rooke et al., 2003; Марковцов и др., 2000; Чоу и др., 1999). Интересно, что белки SR присутствовали только на низких уровнях в двух ранних комплексах, что было измерено с помощью нормализованного фактора спектральной численности (NSAF) и с помощью иммуноблота (рис. 4B, правая панель; дополнительный файл 1). Хотя и не в изобилии, SFRS3 и TRA2B (SFRS10) увеличивались в активном раннем комплексе. Присутствие белков в репрессированных и активных ранних комплексах было подтверждено иммуноблоттингом и дополнительным анализом масс-спектров (рис. 4В, правая панель и см. ниже).
В комплексах присутствовало несколько АТФ-зависимых РНК-геликаз. Известно, что некоторые из них функционируют на более поздних стадиях сборки сплайсосом. Особый интерес представлял DDX17 (p72), который увеличился в 3 раза в активном комплексе вместе с меньшим увеличением его паралога DDX5 (p68) (рис. 4B; дополнительный файл 1). Известно, что эти белки необходимы для сплайсинга нескольких альтернативных экзонов, но мишени их активности точно не определены (Kar et al., 2011; Dardenne et al., 2012; Дарденн и др., 2014). Ранее они были идентифицированы в других экзонных комплексах и очищены совместно с мяРНП U1 и U2 (Sharma et al., 2008; Schneider et al., 2010; Kar et al., 2011; Jurica and Moore, 2003; Hartmuth et al. , 2002; Чу и др., 2015). Их рекрутирование в активный комплекс ранних экзонов до образования EDC может указывать на роль в ремоделировании, которое мы наблюдаем в этом комплексе.
Чтобы дополнительно подтвердить различия в составе экзонных комплексов и их зависимость от PTBP1, мы провели второй эксперимент с МС.В этом эксперименте мы собрали комплексы только на РНК дикого типа в светлом ядерном экстракте HeLa, которые были либо иммунодеплетированы по PTBP1, либо ложно истощены. Это давало активный ранний комплекс и EDC в экстракте, обедненном PTBP1, и репрессированный комплекс в экстракте, лишенном имитации (рис. 2C, дорожки 3 и 4). Перед МС-анализом в эти три легких комплекса добавляли смесь комплексов экзоновых РНП, аффинно очищенных от MS2, из тяжелого экстракта, содержащего как РНК дикого типа, так и мутантные РНК.Эта смесь давала пик тяжелого пептида для всех представляющих интерес белков. Пиковые интенсивности для трех легких комплексов затем нормализовали к пиковым интенсивностям тяжелых СВР20 и СВР80 для измерения относительного содержания каждого белка в каждом легком комплексе.
Многие белки, в том числе описанные выше, показали последовательные изменения между двумя экспериментами с МС (дополнительный файл 1). В первом эксперименте репрессированные и активные ранние комплексы содержали РНК дикого типа и мутантную РНК по сайту связывания PTBP1 соответственно.Во втором эксперименте белки собирали на РНК дикого типа плюс или минус PTBP1. Таким образом, белки, наблюдаемые в обоих экспериментах, реагируют на дифференциальное связывание PTBP1. Белки, наблюдаемые только в одном масс-спектрометрическом эксперименте, далее не рассматривались. Эти результаты показывают, что, несмотря на сходную подвижность геля, комплекс, репрессированный PTBP1, и активный ранний комплекс, который может прогрессировать до EDC, сильно различаются. Связывание PTBP1 в сочетании с MBNL1 и RAVER1 предотвращало связывание многих других белков, включая многие белки hnRNP.Связыванию U2 snRNP с образованием EDC предшествует обширное ремоделирование экзонового RNP из репрессированного в активное состояние.
Затем мы исследовали композиционные изменения во время перехода активного комплекса ранних экзонов в EDC. Мы смешали тяжелый репрессированный комплекс и легкий EDC из первого эксперимента МС в молярном соотношении 1:1 и провели расщепление трипсином и ЖХ-МС-МС. Отношение SILAC для каждого белка (легкий к тяжелому) рассчитывали по интенсивностям пептидных пиков, снова нормированных к CBP80 и CBP20.Нормализованные отношения SILAC из этого набора (EDC сверхподавленные) были разделены на нормализованные отношения SILAC из предыдущего набора (активные ранние сверхподавленные). Это привело к соотношению изобилия белков в EDC по отношению к активному комплексу, из которого он формируется. Эти данные снова указывали на резкие изменения состава при переходе между двумя комплексами.
Многие белки были истощены во время образования EDC (рис. 4C, левая панель). PTBP1, RAVER1 и MBNL1, которые в основном были потеряны между репрессированным и активным ранними комплексами, еще больше снизились в EDC.Большинство белков hnRNP, включая hnRNPA1 и hnRNPA2B1, уменьшались с образованием EDC. Интересно, что такие белки, как hnRNP C, K, U и Q, количество которых в активном комплексе значительно увеличилось по сравнению с репрессированным комплексом, теперь резко уменьшалось в EDC. И наоборот, как и ожидалось, белки snRNP U2 рекрутируются во время этого перехода (рис. 4C, левая панель и рис. 3B, дорожка 3). Возможно, наиболее поразительным изменением при формировании EDC было массовое рекрутирование белков SR, включая SRSF3, 6, 7, 11, 12 и родственные SR белки, TRA2B (SFRS10), RBM39 и LUC7L2.TRA2B и SFRS3 увеличились в 4 раза в EDC по сравнению с активным комплексом, в то время как LUC7L2 увеличился в 8 раз (рис. 4C, левая панель; дополнительный файл 1). Опять же, изменения в белках hnRNP и SR были подтверждены с помощью иммуноблота (рис. 4C, правая панель), и мы наблюдали аналогичные изменения во втором эксперименте с MS с использованием экстракта, обедненного PTBP1 (дополнительный файл 1). Вместе данные указывают на экстенсивное ремоделирование комплексов экзонов как между PTBP1-репрессированным и активным ранним комплексом, так и затем при переходе от активного раннего экзонного комплекса к EDC.Помимо связывания U2 во время этого последнего перехода, белки hnRNP удаляются и рекрутируются белки SR.
Нейродегенеративные заболевания: очаг дефектов сплайсинга и возможные методы лечения | Трансляционная нейродегенерация
Evers MM, Toonen LJ, van Roon-Mom WM. Антисмысловые олигонуклеотиды в терапии нейродегенеративных заболеваний. Adv Drug Del Rev . 2015;87:90–103.
КАС Статья Google ученый
Гуо Дж.Л., Ли В.М.Межклеточная передача патогенных белков при нейродегенеративных заболеваниях. Нат Мед . 2014;20(2):130–8.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Гузелла Дж.Ф., Макдональд М.Э. Молекулярная генетика: разоблачение триггеров полиглутамина при нейродегенеративных заболеваниях. Nat Rev Neurosci . 2000;1(2):109–15.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Миллс Д.Д., Яниц М.Альтернативный сплайсинг мРНК в молекулярной патологии нейродегенеративных заболеваний. Нейробиол Старение. 2012;33(5):1012.e11–24.
Артикул КАС Google ученый
Тейлор Дж. П., Харди Дж., Фишбек К. Х. Токсичные белки при нейродегенеративных заболеваниях. Наука . 2002; 296(5575):1991–5.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Сковронский Д.М., Ли В.М.И., Трояновский Д.К.Нейродегенеративные заболевания: новые концепции патогенеза и их терапевтическое значение. Annu Rev Pathol Mech Dis . 2006; 1:151–70.
КАС Статья Google ученый
Росс, Калифорния, Пуарье, Массачусетс. Агрегация белков и нейродегенеративные заболевания. Нат Мед . 2004;10(7):S10–7.
ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google ученый
Суини П., Парк Х., Бауманн М., Данлоп Дж., Фридман Дж., Копито Р. и др.Неправильный фолдинг белков при нейродегенеративных заболеваниях: последствия и стратегии. Перевод Нейродегенер . 2017;6(1):1–13.
Артикул КАС Google ученый
Зейнеддин Р., Йербери Дж.Дж. Роль макропиноцитоза в распространении агрегации белков, связанной с нейродегенеративными заболеваниями. Фронт Физиол . 2015;6:277.
ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Зогби ХИ, Орр ХТ.Патогенные механизмы полиглутамин-опосредованного нейродегенеративного заболевания, спиноцеребеллярной атаксии типа 1. J Biol Chem . 2009;284(12):7425–9.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Консорциум IWGS. Основанная на хромосомах черновая последовательность генома гексаплоидной мягкой пшеницы (Triticum aestivum). Наука. 2014;345(6194):1251788.
Артикул КАС Google ученый
Neale DB, Wegrzyn JL, Stevens KA, Zimin AV, Puiu D, Crepeau MW, et al.Расшифровка массивного генома сосны лоблолли с использованием гаплоидной ДНК и новых стратегий сборки. Геном Биол . 2014;15(3):1–13.
Артикул КАС Google ученый
Керен Х., Лев-Маор Г., Аст Г. Альтернативный сплайсинг и эволюция: диверсификация, определение экзона и функция. Нат Рев Жене . 2010;11(5):345–55.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Келемен О., Конвертини П., Чжан З., Вен И., Шен М., Фалалеева М. и др.Функция альтернативного сплайсинга. Джин . 2013;514(1):1–30.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Дуглас АГ, Вуд М.Дж. Сплайсинг РНК: болезнь и терапия. Краткая информация о функциях геномики . 2011;10(3):151–64.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Сперлинг Р. Основы эндогенной сплайсосомы.Wiley Interdiscip Rev RNA. 2017;8(1):e1377.
Staley JP, Woolford JL Jr. Сборка рибосом и сплайсосом: сложные рибонуклеопротеиновые машины. Curr Opin Cell Biol . 2009;21(1):109–18.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Will CL, Lührmann R. Структура и функция сплайсосом. Колд Спринг Харб Перспект Биол. 2011;3(7):a003707.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Питу И.Модуляция модификаторов сплайсинга пре-мРНК: терапевтическая стратегия при поддающихся лечению наследственных заболеваниях. Кандидатская диссертация,. Перт, Австралия: Университет Мердока; 2018.
Уорд А.Дж., Купер Т.А. Патобиология сплайсинга. Джей Патол . 2010;220(2):152–63.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Daguenet E, Dujardin G, Valcárcel J. Патогенность дефектов сплайсинга: понимание механизмов обработки пре-мРНК дает новые терапевтические подходы.EMBO Rep . 2015;16(12):1640–55.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Baralle FE, Giudice J. Альтернативный сплайсинг как регулятор развития и тканевой идентичности. Nat Rev Mol Cell Biol . 2017;18(7):437.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Kalea AZ, Schmidt AM, Hudson BI.Альтернативный сплайсинг RAGE: роль в биологии и заболеваниях. Фронт Биоски . 2011;17:2756–70.
Артикул Google ученый
Жюль Дж., Майгель Д., Хадсон Б.И. Альтернативный сплайсинг цитоплазматического домена RAGE регулирует передачу сигналов и функцию клетки. ПЛОС Один . 2013;8(11):e78267.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Дин К., Келлер Дж. Н.Варианты сплайсинга рецептора конечных продуктов расширенного гликозилирования (RAGE) в мозге человека. Нейроски Летт . 2004;373(1):67–72.
Артикул КАС Google ученый
De Conti L, Baralle M, Buratti E. Определение экзона и интрона в сплайсинге пре-мРНК. Wiley Interdiscip Rev RNA . 2013;4(1):49–60.
ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google ученый
Sumanasekera C, Kelemen O, Beullens M, Aubol BE, Adams JA, Sunkara M, et al.Церамид пиридиния C6 влияет на альтернативный сплайсинг пре-мРНК, ингибируя протеинфосфатазу-1. Нуклеиновые кислоты рез. . 2012;40(9):4025–39.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Kondo S, Yamamoto N, Murakami T, Okumura M, Mayeda A, Imaizumi K. Tra2β, SF2/ASF и SRp30c модулируют функцию экзонного энхансера сплайсинга в экзоне 10 тау-пре-мРНК. Гены Клетки . 2004;9(2):121–30.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Тази Дж., Баккур Н., Штамм С. Альтернативный сплайсинг и болезнь. Биохим Биофиз Акта. 2009; 1792(1):14–26.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Хаммонд С.М., Вуд М.Дж. Генетическая терапия болезней неправильного сплайсинга РНК. Тенденции Genet . 2011;27(5):196–205.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Скотти М.М., Суонсон М.С. Неправильный сплайсинг РНК при заболевании. Нат Рев Жене . 2016;17(1):19.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Фишбейн А., Джионо Л.Е., Куальино А., Берардино Б.Г., Сигаут Л., Фон Билдерлинг С. и др. Альтернативный сплайсинг G9a регулирует дифференцировку нейронов.Сотовый представитель . 2016;14(12):2797–808.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Джако М., Вейн-Ванхентенрик С.М., Смердон Дж.В., Ян Р., Фэн Х., Уильямс Д.Дж. и др. Факторы сплайсинга Rbfox способствуют созреванию нейронов и сборке начального сегмента аксона. Нейрон. 2018;97(4):853–68. е6.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Липскомб Д., Андраде А., Аллен С.Е.Альтернативный сплайсинг: функциональное разнообразие потенциалзависимых кальциевых каналов и поведенческие последствия. Биохим Биофи Акта . 2013;1828(7):1522–9.
КАС Статья Google ученый
Lipscombe D, Soto EJL. Альтернативный сплайсинг нейронных генов: новые механизмы и новые методы лечения. Курр Опин Нейробиол . 2019;57:26–31.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Корнберг РД.Контроль транскрипции РНК-полимеразой II. Тенденции Biochem Sci . 1996;21(9):325–6.
КАС Статья Google ученый
Kornblihtt AR, de la Mata M, Feeda JP, Munoz MJ, Nogues G. Множественные связи между транскрипцией и сплайсингом. РНК. 2004; 10(10):1489–98.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Елен Н., Уле Дж., Живин М., Дарнелл Р.Б.Эволюция Nova-зависимой регуляции сплайсинга в головном мозге. ПЛОС Жене . 2007;3(10):e173.
Артикул КАС Google ученый
Kremerskothen J, Teber I, Wendholt D, Liedtke T, Böckers TM, Barnekow A. Специфический для мозга сплайсинг мРНК α-актинина 1 (ACTN1). Biochem Biophys Res Commun . 2002;295(3):678–81.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Мэджвик А., Форт П., Хэнсон П.С., Тибо П., Годро М.-К., Лутфалла Г. и др.Нейронная дифференцировка модулирует специфическую программу сплайсинга мозга позвоночных. ПЛОС Один . 2015;10(5):e0125998.
ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google ученый
Турман К.М., Хэтли Дж.М., Райдер Д.Дж., Равиндранат В., Стробел Х.В. Альтернативный сплайсинг внутри надсемейства цитохромов Р450 человека с акцентом на головной мозг: свертка продолжается. Экспертное заключение Препарат Метаб Токсикол . 2006;2(3):399–418.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Уле Дж., Дарнелл Р.Б. Функциональные и механистические выводы из полногеномных исследований регуляции сплайсинга в головном мозге. Adv Exp Мед Биол . 2007; 623:148–60.
ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Блэк Д., Грабовски П. Альтернативный сплайсинг пре-мРНК и функция нейронов.Прог Мол Субселл Биол . 2003; 31: 187–216.
Lipscombe D. Нейрональные белки, специально разработанные методом альтернативного сплайсинга. Курр Опин Нейробиол . 2005;15(3):358–63.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Porter RS, Jaamour F, Iwase S. Нейрон-специфический альтернативный сплайсинг механизмов транскрипции: последствия для нарушений развития нервной системы.Мол Селл Нейроски . 2018;87:35–45.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Сингх Н.К., Сингх Н.Н., Андрофи Э.Дж., Сингх Р.Н. Сплайсинг критического экзона мотонейрона выживания человека регулируется уникальным сайленсерным элементом, расположенным в последнем интроне. Мол Селл Биол . 2006;26(4):1333–46.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Мэтлин А.Дж., Кларк Ф., Смит К.В.Понимание альтернативного сплайсинга: к сотовому коду. Nat Rev Mol Cell Biol . 2005;6(5):386–98.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Штамм С., Бен-Ари С., Рафальска И., Тан Ю., Чжан З., Тойбер Д. и др. Функция альтернативного сплайсинга. Джин . 2005; 344:1–20.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Черный ДЛ.Механизмы альтернативного сплайсинга пре-мессенджерных РНК. Анну Рев Биохим . 2003;72(1):291–336.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Хайнцен Э.Л., Ге Д., Кронин К.Д., Майя Дж.М., Шианна К.В., Габриэль В.Н. и др. Тканеспецифический генетический контроль сплайсинга: последствия для изучения сложных признаков. ПЛОС Биол . 2008;6(12):e1000001.
Артикул КАС Google ученый
Буш А., Хертель К.Дж.Эволюция белка SR и регуляторных факторов сплайсинга hnRNP. Wiley Interdiscip Rev: RNA . 2012;3(1):1–12.
Furlanis E, Traunmüller L, Fucile G, Scheiffele P. Ландшафт изоформ транскриптов, связанных с рибосомами, показывает обширные программы альтернативного сплайсинга, специфичные для класса нейронов. Нат Нейроски . 2019;22(10):1709–17.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Выонг К.К., Блэк Д.Л., Чжэн С.Нейрогенетика альтернативного сплайсинга. Nat Rev Neurosci . 2016;17(5):265–81.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Коутиньо-Мэнсфилд GC, Xue Y, Zhang Y, Fu XD. Переключатель PTB/nPTB: посттранскрипционный механизм программирования дифференцировки нейронов. Гены Дев. 2007;21(13):1573–1577.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Макеев Э.В., Чжан Дж., Карраско М.А., Маниатис Т.МикроРНК miR-124 способствует дифференцировке нейронов путем запуска специфичного для мозга альтернативного сплайсинга пре-мРНК. Мол Ячейка. 2007;27(3):435–48.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Мокаббер Х., Наджафзаде Н., Мохаммадзаде В.М. миР-124 способствует дифференцировке нейронов в стволовых клетках выпуклости мышей путем репрессии Ptbp1 и Sox9. J Cell Physiol . 2019;234(6):8941–50.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Линг Дж. П., Чабра Р., Мерран Дж. Д., Шогэнси П. М., Уилан С. Дж., Корден Дж. Л. и др.PTBP1 и PTBP2 репрессируют неконсервативные криптические экзоны. Сотовый представитель . 2016;17(1):104–13.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Quesnel-Vallières M, Irimia M, Cordes SP, Blencowe BJ. Основные роли регулятора сплайсинга nSR100/SRRM4 в развитии нервной системы. Гены Дев . 2015;29(7):746–59.
ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google ученый
Охниси Т., Ширане М., Накаяма К.И.SRRM4-зависимый нейрон-специфический альтернативный сплайсинг транскриптов протрудинов регулирует рост нейритов. Научный представитель . 2017;7:41130.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Irimia M, Weatheritt RJ, Ellis JD, Parikshak NN, Gonatopoulos-Pournatzis T, Babor M, et al. Высококонсервативная программа нейронных микроэкзонов неправильно регулируется в мозге аутистов. Сотовый . 2014;159(7):1511–23.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Радж Б., Иримия М., Брауншвейг У., Стерн-Вейлер Т., О’Хэнлон Д., Лин З.И. и др. Глобальный регуляторный механизм для активации экзонной сети, необходимой для нейрогенеза. Мол Селл . 2014;56(1):90–103.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Мелдолеси Дж.Альтернативный сплайсинг факторами NOVA: от экспрессии генов к физиологии и патологии клеток. Int J Mol Sci. 2020;21(11):3941.
КАС Статья Google ученый
Яно М., Хаякава-Яно Ю., Меле А., Дарнелл Р.Б. Nova2 регулирует миграцию нейронов посредством переключателя РНК в передаче сигналов disabled-1. Нейрон . 2010;66(6):848–58.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Бок Х.Х., Мэй П.Каноническая и неканоническая сигнализация Рилина. Передняя ячейка Neurosci . 2016;10:166.
ПабМед ПабМед Центральный Google ученый
Фёрстер Э., Джоссин Ю., Чжао С., Чай Х., Фрочер М., Гоффине А.М. Недавний прогресс в понимании роли рилина в радиальной миграции нейронов с особым акцентом на зубчатую извилину. Евр Дж Нейроски . 2006;23(4):901–9.
ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Перес-Гарсия К.Г., Тиссир Ф., Гоффине А.М., Мейер Г.Рецепторы рилина в развивающихся многослойных структурах мозга мыши и человека. Евр Дж Нейроски . 2004;20(10):2827–32.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Фёрстер Э., Бок Х.Х., Герц Дж., Чай Х., Фрочер М., Чжао С. Новые темы в функции Рилина. Евр Дж Нейроски . 2010;31(9):1511–8.
ПабМед ПабМед Центральный Google ученый
Li Q, Lee JA, Black DL.Нейрональная регуляция альтернативного сплайсинга пре-мРНК. Nat Rev Neurosci . 2007;8(11):819–31.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Li Q, Zheng S, Han A, Lin CH, Stoilov P, Fu XD, et al. Регулятор сплайсинга PTBP2 контролирует программу эмбрионального сплайсинга, необходимую для созревания нейронов. Элиф . 2014;3:e01201.
ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Гехман Л.Т., Стойлов П., Магуайр Дж., Дамианов А., Лин Ч.Х., Шиуэ Л. и др.Регулятор сплайсинга Rbfox1 (A2BP1) контролирует возбуждение нейронов в мозге млекопитающих. Нат Жене . 2011;43(7):706–11.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Gehman LT, Meera P, Stoilov P, Shiue L, O’Brien JE, Meisler MH, et al. Регулятор сплайсинга Rbfox2 необходим как для развития мозжечка, так и для зрелой двигательной функции. Гены Дев . 2012;26(5):445–60.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Lee JA, Damianov A, Lin CH, Fontes M, Parikshak NN, Anderson ES, et al.Цитоплазматический Rbfox1 регулирует экспрессию синаптических и связанных с аутизмом генов. Нейрон . 2016;89(1):113–28.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Ghiglieri V, Calabrese V, Calabresi P. Альфа-синуклеин: от ранней синаптической дисфункции до нейродегенерации. Фронт Нейрол . 2018;9:295.
ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Хоу Х, Вацлавик Ю.О., Физель Ф.К., Спрингер В.Аутофагия при болезни Паркинсона. Дж Мол Биол . 2020;432(8):2651–72.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Солл Л.Г., Эйзен Дж.Н., Варгас К.Дж., Медейрос А.Т., Хаммар К.М., Морган Дж.Р. α-Synuclein-112 нарушает рециркуляцию синаптических пузырьков в соответствии с его улучшенными свойствами связывания с мембраной. Front Cell Dev Biol. 2020;8:405.
ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Викарио М., Сиери Д., Брини М., Кали Т.Тесное столкновение между альфа-синуклеином и митохондриями. Фронт Нейроски . 2018;12:388.
ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Гамес-Валеро А., Бейер К. Альтернативный сплайсинг генов альфа- и бета-синуклеина играет дифференциальную роль в синуклеинопатиях. Гены . 2018;9(2):63.
Артикул КАС Google ученый
Дже Г., Гухатакурта С., Юн С.П., Ко Х.С., Ким Ю.С.Новая расширенная форма альфа-синуклеина 3’UTR в мозге человека. Мол Мозг . 2018;11(1):29.
ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google ученый
Tseng E, Rowell WJ, Glenn OC, Hon T, Barrera J, Kujawa S, et al. Ландшафт транскриптов SNCA при синуклеинопатиях: новые идеи из анализа секвенирования длинных чтений. Передний Жене . 2019;10:584.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Кадзи С., Маки Т., Ишимото Т., Ямакадо Х., Такахаши Р.Взгляд на патогенез множественной системной атрофии: внимание на глиальные цитоплазматические включения. Перевод Нейродегенер . 2020;9:7.
ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google ученый
Oueslati A. Влияние фосфорилирования альфа-синуклеина на S129 на синуклеинопатии: чему мы научились за последнее десятилетие? Дж. Паркинсон Дис . 2016;6(1):39–51.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Браак Х., Гебремедхин Э., Рюб У., Братцке Х., Дель Тредичи К.Стадии развития патологии, связанной с болезнью Паркинсона. Резистентность клеточной ткани . 2004;318(1):121–34.
ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Виннакота Р.Л., Йедлапуди Д., Манда К.М., Бхамидипати К., Боммаканти К.Т., РангаЛакшми Г.С. и др. Идентификация альтернативно сплайсированной изоформы α-синуклеина, которая генерирует N-концевой укороченный пептид из 41 аминокислоты, 41-syn: роль в гомеостазе дофамина.ACS Chem Neurosci . 2018;9(12):2948–58.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Крупенко С.А., Хорита Д.А. Роль однонуклеотидных полиморфизмов в функции кандидата в опухолевые супрессоры ALDh2L1. Передний Жене . 2019;10:1013.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Солднер Ф., Стельцер Ю., Шивалила С.С., Абрахам Б.Дж., Латурель Дж.С., Барраса М.И. и др.Вариант риска, связанный с болезнью Паркинсона, в дистальном энхансере α-синуклеина модулирует экспрессию гена-мишени. Природа . 2016;533(7601):95–9.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Гухатакурта С., Бок Э., Евангелиста Б.А., Ким Ю.С. Нарушение регуляции α-синуклеина при болезни Паркинсона: взгляд на эпигенетическую структуру и регуляцию транскрипции SNCA. Прог Нейробиол . 2017; 154:21–36.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
McCarthy JJ, Linnertz C, Saucier L, Burke JR, Hulette CM, Welsh-Bohmer KA, et al. Влияние 3′-области SNCA на уровни варианта сплайсинга SNCA-112. Нейрогенетика . 2011;12(1):59–64.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Campêlo CLC, Cagni FC, de Siqueira FD, Oliveira LG Jr, Silva-Neto AB, Macêdo PT и др.Варианты в гене SNCA связаны с риском развития болезни Паркинсона и когнитивными симптомами в образце из Бразилии. Фронт старения Neurosci . 2017;9:198.
ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google ученый
Барри Э.С., Ли С.Х., Фратер Дж.Т., Катаки М., Шарре Д.В., Сэди В. Образование и трансляция изоформы мРНК альфа-синуклеина, затронутые полиморфизмом в SNCA 3’UTR человека. Мол Генет Геномик Мед . 2018;6(4):565–74.
КАС Статья Google ученый
Чиба-Фалек О. Структурные варианты гена SNCA и их влияние на синуклеинопатии. Curr Opin Genet Dev . 2017;44:110–6.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Beyer K, Humbert J, Ferrer A, Lao JI, Latorre P, Lopez D, et al. Вариабельная последовательность поли-Т модулирует экспрессию изоформы альфа-синуклеина и связана со старением.J Neurosci Res . 2007;85(7):1538–46.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Tolosa E, Vila M, Klein C, Rascol O. LRRK2 при болезни Паркинсона: проблемы клинических испытаний. Нат Рев Нейрол . 2020;16(2):97–107.
ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Ла Коньята В., Д’Агата В., Кавальканти Ф., Кавалларо С.Сплайсинг: есть ли альтернативный вклад в болезнь Паркинсона? Нейрогенетика . 2015;16(4):245–63.
ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google ученый
Tan SH, Karri V, Tay NWR, Chang KH, Ah HY, Ng PQ и др. Новые пути к нейродегенерации: анализ критических молекулярных механизмов при болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона. Биомед Фармаколог. 2019;111:765–77.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Ду Х, Ван Х, Гэн М.Гипотеза болезни Альцгеймера и связанные с ней методы лечения. Перевод Нейродегенер . 2018;7:2.
ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google ученый
Сили М.А., Вурку Э., Коуэн С.М., Боссинг Т., Курайше С., Грамменуди С. и др. Различные фенотипы трех- и четырехкратного тау-белка человека в трансгенной модели таупатии. Нейробиол Дис . 2017;105:74–83.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Мандельков Э.М., Швирс О., Древес Г., Бирнат Дж., Густке Н., Тринчек Б. и другие.Структура, взаимодействие микротрубочек и фосфорилирование тау-белка. Ann NY Acad Sci . 1996; 777: 96–106.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Алонсо А.Д., Коэн Л.С., Корбо С., Морозова В., Элидрисси А., Филлипс Г. и др. Гиперфосфорилирование тау ассоциируется с изменениями его функции, выходящими за рамки стабильности микротрубочек. Передняя ячейка Neurosci . 2018;12:338.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Странг К.Х., Голде Т.Е., Гиассон Б.И.Мутации MAPT, таупатия и механизмы нейродегенерации. Лаборатория Инвест . 2019;99(7):912–28.
ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Qian W, Liu F. Регуляция альтернативного сплайсинга экзона тау 10. Neurosci Bull . 2014;30(2):367–77.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Симс Р., Хилл М., Уильямс Дж.Мультиплексная модель генетики болезни Альцгеймера. Нат Нейроски . 2020;23(3):311–22.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Scheltens P, Blennow K, Breteler MM, de Strooper B, Frisoni GB, Salloway S, et al. Болезнь Альцгеймера. Ланцет . 2016;388(10043):505–17.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Ган С.Л., Чжан Т., Ли Т.Х.Генетика болезни Альцгеймера у населения Китая. Int J Mol Sci. 2020;21(7):2381.
КАС Статья Google ученый
Wang X, Zhou X, Li G, Zhang Y, Wu Y, Song W. Модификации и торговля АРР в патогенезе болезни Альцгеймера. Фронт Мол Нейроски . 2017;10:294.
ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google ученый
Арбер С., Тумбс Дж., Лавджой С., Райан Н.С., Патерсон Р.В., Виллумсен Н. и др.Нейроны, полученные от пациентов с семейной болезнью Альцгеймера, обнаруживают отчетливые специфические мутационные эффекты на бета-амилоид. Мол Психиатрия . 2020;25(11):2919–31.
ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Kelleher RJ 3rd, Shen J. Мутации пресенилина-1 и болезнь Альцгеймера. Proc Natl Acad Sci U S A . 2017;114(4):629–31.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Сунь Л., Чжоу Р., Ян Г., Ши Ю.Анализ 138 патогенных мутаций в пресенилине-1 на продукцию in vitro пептидов Aβ42 и Aβ40 под действием γ-секретазы. Proc Natl Acad Sci U S A . 2017;114(4):E476–e85.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Рамирес Агилар Л., Акоста-Урибе Дж., Хиральдо М.М., Морено С., Баэна А., Альзате Д. и др. Генетическое происхождение большой семьи с новой мутацией PSEN1 (Ile416Thr). Альцгеймер Демент . 2019;15(5):709–19.
ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Ровеле-Лекрю А., Шарбонье С., Валлон Д., Николя Г., Моряк М.Н., Потье С. и др. Вредные генетические вариации de novo нацелены на биологическую сеть, сосредоточенную на пептиде Aβ, при болезни Альцгеймера с ранним началом. Мол Психиатрия . 2015;20(9):1046–56.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Перроне Ф., Какаче Р., Ван Моссевельде С., Ван ден Босше Т., Де Дейн П.П., Крас П. и др.Генетический скрининг у пациентов с ранним началом деменции с неясным фенотипом: актуальность для клинической диагностики. Нейробиол Старение. 2018;69:292.e7–92.e14.
Артикул Google ученый
Джаядев С., Леверенц Дж. Б., Стейнбарт Э., Шталь Дж., Кланк В., Ю К. Э. и другие. Фенотипы и генотипы болезни Альцгеймера, связанные с мутациями пресенилина 2. Мозг . 2010; 133 (часть 4): 1143–54.
ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Braggin JE, Bucks SA, Course MM, Smith CL, Sopher B, Osnis L, et al.Альтернативный сплайсинг в варианте пресенилина 2, связанный с болезнью Альцгеймера. Энн Клин Перевод Neurol . 2019;6(4):762–77.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Ebrahimie E, Moussavi Nik SH, Newman M, Van Der Hoek M, Lardelli M. Эквивалент изоформы PS2V, связанной с болезнью Альцгеймера, у рыбок данио ПРЕЗЕНИЛИН регулирует воспалительные и другие реакции на гипоксический стресс. Дж. Болезнь Альцгеймера . 2016;52(2):581–608.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Муссави Ник С.Х., Ньюман М., Уилсон Л., Эбрахими Э., Уэллс С., Масгрейв И. и др. Пептид PS2V, связанный с болезнью Альцгеймера, играет древнюю, консервативную роль в подавлении развернутого белкового ответа при гипоксии и стимуляции активности γ-секретазы. Хум Мол Жене . 2015;24(13):3662–78.
ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google ученый
Уильямс Т., Борчелт Д.Р., Чакрабарти П.Терапевтические подходы, направленные на функцию аполипопротеина Е при болезни Альцгеймера. Мол Нейродегенер . 2020;15(1):8.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Сафие М., Корчин А.Д., Майклсон Д.М. ApoE4: новая терапевтическая мишень для болезни Альцгеймера. БМС Мед . 2019;17(1):64.
ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Гилат-Френкель М., Бём-Каган А., Лираз О., Сиань Х., Герц Дж., Михельсон Д.М.Участие рецепторов Apoer2 и Lrp1 в опосредовании патологических эффектов ApoE4 in vivo. Curr Alzheimer Res . 2014;11(6):549–57.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Gallo CM, Ho A, Beffert U. ApoER2: функциональная настройка посредством сплайсинга. Фронт Мол Нейроски . 2020;13:144.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Wasser CR, Masiulis I, Durakoglugil MS, Lane-Donovan C, Xian X, Beffert U, et al.Дифференциальный сплайсинг и гликозилирование Apoer2 изменяет синаптическую пластичность и обучение страху. Научный сигнал. 2014;7(353):ra113.
ПабМед ПабМед Центральный Google ученый
Браун Р. Х. мл. Боковой амиотрофический склероз. Информация из генетики. Арка Нейрол . 1997;54(10):1246–50.
ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Бэмптон А., Гиттингс Л.М., Фратта П., Лэшли Т., Гатт А.Роль hnRNP при лобно-височной деменции и боковом амиотрофическом склерозе. Акта Нейропатол . 2020;140(5):599–623.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Абрамзон Ю.А., Фратта П., Трейнор Б.Дж., Чиа Р. Перекрывающаяся генетика бокового амиотрофического склероза и лобно-височной деменции. Фронт Нейроски . 2020;14:42.
ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Гендрон ТФ, Петручелли Л.Механизмы заболевания экспансии повторов C9ORF72. Колд Спринг Харб Перспект Мед. 2018;8(4):a024224.
ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google ученый
Yang Q, Jiao B, Shen L. Развитие C9orf72-ассоциированного бокового амиотрофического склероза и лобно-височной деменции. Передний Жене . 2020;11:562758.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Баркер Х.В., Ниблок М., Ли Ю.Б., Шоу К.Э., Галло Дж.М.Неправильный процессинг РНК при нейродегенерации, связанной с C9orf72. Передняя ячейка Neurosci . 2017;11:195.
ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google ученый
Конлон Э.Г., Лу Л., Шарма А., Ямадзаки Т., Танг Т., Шнайдер Н.А. и др. Экспансия C9ORF72 GGGGCC образует включения G-квадруплекса РНК и изолирует hnRNP H, чтобы нарушить сплайсинг в мозге ALS. Элиф . 2016;5:e17820.
Deshaies JE, Shkreta L, Moszczynski AJ, Sidibé H, Semmler S, Fouillen A, et al.TDP-43 регулирует альтернативный сплайсинг hnRNP A1 с образованием склонного к агрегации варианта при боковом амиотрофическом склерозе. Мозг . 2018;141(5):1320–33.
ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Бутти З., Паттен С.А. Дисрегуляция РНК при боковом амиотрофическом склерозе. Передний Жене . 2018;9:712.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Трипольски К., Торок Д., Гуденеж Д., Фаркаш К., Сулак А., Торок Н. и др.Высокопроизводительное секвенирование выявило новую мутацию SETX у венгерского пациента с боковым амиотрофическим склерозом. Мозг Поведение . 2017;7(4):e00669.
ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Маруяма Х., Морино Х., Ито Х., Изуми Ю., Като Х., Ватанабэ Ю. и др. Мутации оптиневрина при боковом амиотрофическом склерозе. Природа . 2010;465(7295):223–6.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Perrone B, La Cognata V, Sprovieri T, Ungaro C, Conforti FL, Andò S и др.Альтернативный сплайсинг генов БАС: неправильная регуляция и возможные методы лечения. Селл Мол Нейробиол . 2020;40(1):1–14.
ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Колб С.Дж., Коффи К.С., Янки Дж.В., Кросселл К., Арнольд В.Д., Рутков С.Б. и др. Естественная история детской спинальной мышечной атрофии. Энн Нейрол . 2017;82(6):883–91.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Prior TW, Krainer AR, Hua Y, Swoboda KJ, Snyder PC, Bridgeman SJ, et al.Положительный модификатор спинальной мышечной атрофии в гене SMN2. Am J Hum Genet . 2009;85(3):408–13.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Slaugenhaupt SA, Gusella JF. Семейная дисавтономия. Curr Opin Genet Dev . 2002;12(3):307–11.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Anderson SL, Coli R, Daly IW, Kichula EA, Rork MJ, Volpi SA, et al.Семейная дисавтономия вызывается мутациями гена IKAP. Am J Hum Genet . 2001;68(3):753–8.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
He F, Jacobson A. Бессмысленный распад мРНК: распад дефектных транскриптов — это только часть истории. Анну Рев Жене . 2015;49:339–66.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Дитрих П., Драгацис И.Семейная дисавтономия: механизмы и модели. Генет Мол Биол . 2016;39(4):497–514.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Полсон Х. Болезни повторной экспансии. Ручка Clin Neurol . 2018;147:105–23.
ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Чжан Н., Ашизава Т. Токсичность РНК и образование очагов при заболеваниях, связанных с микросателлитной экспансией.Curr Opin Genet Dev . 2017;44:17–29.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Ла Спада АР, Тейлор Дж.П. Болезнь повторной экспансии: прогресс и загадки патогенеза болезни. Нат Рев Жене . 2010;11(4):247–58.
ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google ученый
Гатчел младший, Зогби Х.И.Болезни нестабильной повторной экспансии: механизмы и общие принципы. Нат Рев Жене . 2005;6(10):743–55.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Хейл М.А., Джонсон Н.Е., Берглунд Дж.А. Ассоциированная с повторами структура РНК и аберрантный сплайсинг. Biochim Biophys Acta Gene Regul Mech . 2019;1862(11-12):194405.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Ромо Л., Мон Э.С., Аронин Н.Свежий взгляд на процессинг мРНК Гентингтина при болезни Гентингтона. Дж Хантингтон Дис . 2018;7(2):101–8.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Кеменер А.М., Бачело Л., Форестье А., Донну-Фурне Э., Жило Д., Галибер М.Д. Мощный мир антисмысловых олигонуклеотидов: от скамейки до кровати. Wiley Interdiscip Rev RNA . 2020;11(5):e1594.
ПабМед ПабМед Центральный Google ученый
Disterer P, Kryczka A, Liu Y, Badi YE, Wong JJ, Owen JS, et al.Разработка терапевтических олигонуклеотидов, переключающих сплайсинг. Гул Джин Тер . 2014;25(7):587–98.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Brolin C, Lim EWK, Nielsen PE. In vivo введение ПНК с переключением сплайсинга с использованием мыши mdx в качестве модельной системы. Методы Мол Биол . 2020;2105:241–50.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Коле Р., Крайнер А.Р., Альтман С.РНК-терапия: помимо РНК-интерференции и антисмысловых олигонуклеотидов. Nat Rev Drug Discov . 2012;11(2):125–40.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Ли Д., Масталья Флорида, Флетчер С., Уилтон С.Д. Прецизионная медицина за счет пропуска экзонов, опосредованного антисмысловыми олигонуклеотидами. Trends Pharmacol Sci . 2018;39(11):982–94.
ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google ученый
Хворова А., Уоттс Дж.К.Химическая эволюция олигонуклеотидной терапии клинического применения. Нат Биотехнолог . 2017;35(3):238–48.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Zamecnik PC, Stephenson ML. Ингибирование репликации вируса саркомы Рауса и трансформации клеток специфическим олигодезоксинуклеотидом. Proc Natl Acad Sci U S A . 1978;75(1):280–4.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Aung-Htut MT, McIntosh CS, Ham KA, Pitout IL, Flynn LL, Greer K, et al.Системный подход к разработке антисмысловых олигонуклеотидов, модулирующих сплайсинг. Int J Mol Sci. 2019;20(20):5030.
КАС Статья Google ученый
Флетчер С., Ханиман К., Фолл А.М., Хардинг П.Л., Джонсен Р.Д., Штайнхаус Д.П. и др. Пропуск экзонов, опосредованный олигомерами морфолино, предотвращает начало дистрофической патологии у мышей mdx. Мол Тер . 2007;15(9):1587–92.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Макклори Г., Фолл А.М., Моултон Х.М., Иверсен П.Л., Раско Д.Е., Райан М. и др.Индуцированный пропуск экзона дистрофина в эксплантатах мышц человека. Нервно-мышечное расстройство . 2006;16(9-10):583–90.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Хардинг П.Л., Фолл А.М., Ханиман К., Флетчер С., Уилтон С.Д. Влияние длины антисмыслового олигонуклеотида на пропуск экзона дистрофина. Мол Тер . 2007;15(1):157–66.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
McIntosh CS, Aung-Htut MT, Fletcher S, Wilton SD.Удаление полиглутаминового повтора атаксина-3 путем перенаправления процессинга пре-мРНК. Int J Mol Sci. 2019;20(21):5434.
КАС Статья Google ученый
Форсбах А., Неморин Дж. Г., Монтино С., Мюллер С., Самуловиц У., Викари А. П. и др. Идентификация мотивов последовательности РНК, стимулирующих специфичные к последовательности TLR8-зависимые иммунные ответы. Дж Иммунол . 2008;180(6):3729–38.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Ли Д., Масталья Флорида, Флетчер С., Уилтон С.Д.Прогресс в молекулярном патогенезе и терапии нуклеиновыми кислотами болезни Паркинсона в эпоху точной медицины. Медицинская служба Rev . 2020;40(6):2650–81.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Аунг-Хтут М.Т., Макинтош К.С., Вест К.А., Флетчер С., Уилтон С.Д. Проверка in vitro фосфородиамидатных морфолиноолигомеров. Молекулы. 2019;24(16):2922.
КАС Статья Google ученый
Саммертон JE.Сравнение морфолино, миРНК и S-ДНК: влияние структуры и механизма действия на нецелевые эффекты и специфичность последовательности. Курр Топ Мед Хим . 2007;7(7):651–60.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Арора В., Деви Г.Р., Иверсен П.Л. Нейтрально заряженные фосфородиамидатные морфолино антисмысловые олигомеры: поглощение, эффективность и фармакокинетика. Карр Фарм Биотехнолог . 2004;5(5):431–9.
КАС Статья Google ученый
Саммертон Дж., Веллер Д. Антисмысловые олигомеры морфолино: дизайн, получение и свойства. Препарат антисмысловой нуклеиновой кислоты Dev . 1997;7(3):187–95.
КАС Статья Google ученый
Аартсма-Рус А, Кори Д.Р. Одобрена 10-я олигонуклеотидная терапия: Голодирсен при мышечной дистрофии Дюшенна.Нуклеиновая кислота Ther . 2020;30(2):67–70.
Анвар С., Йокота Т. Голодирсен для лечения мышечной дистрофии Дюшенна. Наркотики сегодня (Barc) . 2020;56(8):491–504.
КАС Статья Google ученый
Alfano LN, Charleston JS, Connolly AM, Cripe L, Donoghue C, Dracker R, et al. Длительное лечение этеплирсеном у неходячих пациентов с мышечной дистрофией Дюшенна. Медицина (Балтимор) . 2019;98(26):e15858.
ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Beggs AH, Hoffman EP, Snyder JR, Arahata K, Specht L, Shapiro F, et al. Изучение молекулярной основы изменчивости у пациентов с мышечной дистрофией Беккера: исследования генов и белков дистрофина. Am J Hum Genet . 1991;49(1):54–67.
КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый
Hua Y, Sahashi K, Hung G, Rigo F, Passini MA, Bennett CF, et al.Антисмысловая коррекция сплайсинга SMN2 в ЦНС избавляет от некроза на модели мышей со СМА III типа. Гены Дев . 2010;24(15):1634–44.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Анна А., Моника Г. Мутации сплайсинга при генетических нарушениях человека: примеры, обнаружение и подтверждение. J Appl Genet . 2018;59(3):253–68.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Finkel RS, Mercuri E, Darras BT, Connolly AM, Kuntz NL, Kirschner J, et al.Нусинерсен против ложного контроля при детской спинальной мышечной атрофии. N Engl J Med . 2017;377(18):1723–32.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Мастен М.С., Минк Ю.В., Августин Э.Ф. Болезнь Баттена: обновленная информация экспертов об агентах в доклинических и клинических испытаниях. Экспертное заключение Investig Drugs . 2020;29(12):1317–22.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Аартсма-Рус А, Уоттс Дж.К.Мюнхенская встреча: медицинское созревание, больше механизмов и миласен. Нуклеиновая кислота Ther . 2019;29(6):302–4.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Корецка Дж.А., Томас Р., Кристенсен Д.П., Хинрих А.Дж., Феррари Э.Дж., Леви С.А. и др. Митохондриальный клиренс и созревание аутофагосом нарушены в фибробластах пациентов с семейной болезнью Паркинсона LRRK2 G2019S. Хум Мол Жене . 2019;28(19):3232–43.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Korecka JA, Talbot S, Osborn TM, de Leeuw SM, Levy SA, Ferrari EJ, et al. Коллапс нейритов и измененный контроль ER Ca (2+) в нейронах, полученных из иПСК человека, страдающих болезнью Паркинсона, с мутацией LRRK2 G2019S. Отчеты о стволовых клетках . 2019;12(1):29–41.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Корецка Дж.А., Томас Р., Хинрих А.Дж., Москитес А.М., Макбейн З.К., Халлетт П.Дж. и др.Антисмысловые олигонуклеотиды с переключением сплайсинга снижают активность киназы LRRK2 у трансгенных мышей LRRK2 человека. Мол Тер Нуклеиновые Кислоты . 2020;21:623–35.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Haylett W, Swart C, van der Westhuizen F, van Dyk H, van der Merwe L, van der Merwe C, et al. Измененное митохондриальное дыхание и другие особенности митохондриальной функции в паркин-мутантных фибробластах у пациентов с болезнью Паркинсона.Паркинсон Дис . 2016;2016:1819209.
ПабМед ПабМед Центральный Google ученый
Асаи Х., Хирано М., Кирияма Т., Икеда М., Уэно С. Естественное и экспериментальное восстановление дефицита гена паркина при аутосомно-рецессивном ювенильном паркинсонизме. Biochem Biophys Res Commun . 2010;391(1):800–5.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Trempe JF, Sauvé V, Grenier K, Seirafi M, Tang MY, Ménade M, et al.Структура паркина раскрывает механизмы активации убиквитинлигазы. Наука . 2013;340(6139):1451–5.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Ли Д., Аунг-Хтут М.Т., Хэм К.А., Флетчер С., Уилтон С.Д. Интервенционная терапия сплайсинга для аутосомно-рецессивной ювенильной болезни Паркинсона, возникающей из-за мутаций Паркина. Int J Mol Sci. 2020;21(19):7282.
КАС Статья Google ученый
Стивенсон Т.Дж., Мюррей Х.К., Тернер С., Фолл Р.Л.М., Дирикс Б.В., Кертис М.А.Включения α-синуклеина многочисленны в ненейрональных клетках в переднем обонятельном ядре обонятельной луковицы при болезни Паркинсона. Научный представитель . 2020;10(1):6682.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Галлардо Г., Хольцман Д.М. Терапевтические препараты антител, нацеленные на Aβ и тау. Колд Спринг Харб Перспект Мед. 2017;7(10):a024331.
ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google ученый
Чакраварти М., Чен С., Додд П.Р., Веду Р.Н.Тераностика на основе нуклеиновых кислот для борьбы с болезнью Альцгеймера. Тераностика . 2017;7(16):3933–47.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Чанг Дж.Л., Хинрих А.Дж., Роман Б., Норрбом М., Риго Ф., Марр Р.А. и др. Нацеливание на белок-предшественник амилоида-β, app, сплайсинг с антисмысловыми олигонуклеотидами снижает продукцию токсического амилоида-β. Мол Тер . 2018;26(6):1539–51.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Чакраварти М., Веду Р.Н.Ингибирование BACE1 с использованием стерически блокирующих антисмысловых олигонуклеотидов 2′-OMePS. Гены (Базель). 2019;10(9):705.
КАС Статья Google ученый
Ву Л., Чжао Л. ApoE2 и болезнь Альцгеймера: время рассмотреть поближе. Нейронная регенерация Res . 2016;11(3):412–3.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Huynh TV, Liao F, Francis CM, Robinson GO, Serrano JR, Jiang H, et al.Возрастные эффекты снижения апоЕ с помощью антисмысловых олигонуклеотидов в модели β-амилоидоза. Нейрон. 2017;96(5):1013–23.e4.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Hinrich AJ, Jodelka FM, Chang JL, Brutman D, Bruno AM, Briggs CA, et al. Терапевтическая коррекция сплайсинга ApoER2 у мышей с болезнью Альцгеймера с использованием антисмысловых олигонуклеотидов. ЭМБО Мол Мед . 2016;8(4):328–45.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Hayes L, Coyne A, Jafar-Nejad P, Rigo F, Rothstein J. Антисмысловые олигонуклеотиды, специфичные для цепи C9ORF72-ALS/FTD (S25.004). Неврология. 2018;90(15 Дополнение):S25.004.
Google ученый
Zhu Q, Jiang J, Gendron TF, McAlonis-Downes M, Jiang L, Taylor A, et al. Снижение функции C9ORF72 усугубляет увеличение токсичности от ALS/FTD, вызывающего повторную экспансию в C9orf72.Нат Нейроски . 2020;23(5):615–24.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Поплавски С.Г., Гарбетт К.А., МакМахан Р.Л., Кордасевич Х.Б., Чжао Х., Кеннеди А.Дж. и др. Антисмысловой олигонуклеотид приводит к подавлению транскрипции Hdac2 и усилению долговременной памяти. Мол Тер Нуклеиновые Кислоты . 2020;19:1399–412.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Рохилла К.Дж., Ганьон К.Т.РНК-биология связанных с заболеванием экспансий микросателлитных повторов. Acta Neuropathol Commun . 2017;5(1):63.
ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google ученый
Toonen LJA, Rigo F, van Attikum H, van Roon-Mom WMC. Опосредованное антисмысловыми олигонуклеотидами удаление полиглутаминового повтора у мышей со спиноцеребеллярной атаксией 3 типа. Мол Тер Нуклеиновые Кислоты . 2017;8:232–42.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Mueller C, Berry JD, McKenna-Yasek DM, Gernoux G, Owegi MA, Pothier LM, et al.Супрессия SOD1 аденоассоциированным вирусом и микроРНК при семейном БАС. N Engl J Med . 2020;383(2):151–8.
КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый
Уилтон С.Д., Флетчер С., Флинн Л., Аккари П.А. Лечение заболевания, связанного с SOD1. 2020. Номер публикации: WO/2020/222182
. Google ученый
CADD-Splice — улучшение предсказания эффектов вариантов в масштабах всего генома с использованием показателей сплайсинга, полученных методом глубокого обучения | Genome Medicine
Набор данных репортерного анализа MFASS для эффектов сплайсинга
Набор данных MFASS [26] был загружен с GitHub (https://github.com/KosuriLab/MFASS/). Набор данных был разделен на интронные ( n = 13 603) и экзонные ( n = 14 130) варианты, как определено Cheung et al. [26]. Кроме того, набор данных был разделен на варианты, нарушающие сплайсинг (sdv, n = 1050) и варианты, которые не нарушают сплайсинг (no-sdv, n = 26 683) в зависимости от того, изменилось ли отношение psi тестируемого экзона. более чем на 0,5 (Δpsi > 0,5). Мы исследовали дополнительные пороги при 0,7, 0,3 и 0,1, а также использовали только варианты с ∆psi > 0.5 для набора sdv и варианты с Δpsi < 0,1 для набора без sdv. При сравнении производительности количество вариантов немного сокращается, так как учитываются только те варианты, для которых определены все протестированные оценки. Значения Psi были загружены в натуральном масштабе с набором данных MFASS.
Предикторы эффектов сплайсинга
Оценки dbscSNV v1.1 [33] были загружены с https://sites.google.com/site/jpopgen/dbNSFP. Модель случайного леса dbscSNV показана в сравнении производительности. CADD начал интегрировать две модели dbscSNV (случайный лес и AdaBoost) в версии 1.4. Оценки Hexamere HAL [37] были сгенерированы с использованием сценариев модели HAL от Kipoi [43]. Оценки HAL, включая процент сплайсинга (psi), были загружены с набором данных MFASS, первоначально полученным через веб-сайт HAL http://splicing.cs.washington.edu/ для вариантов с пропуском экзона авторами MFASS [26]. Оценки S-CAP [32] (v1.0) были загружены с http://bejerano.stanford.edu/scap/. Все восемь оценок S-CAP были объединены в одну оценку, взяв максимальное значение для каждого варианта. Если это было специально указано и в соответствии с определением S-CAP, варианты без предварительно рассчитанного балла расценивались как доброкачественные (показатель S-CAP = 0).Оценки Spidex [39] (v1.0, некоммерческая версия) были загружены с http://assets.deepgenomics.com/spidex_public_noncommercial_v1_0.tar.
Оценки MMSplice [40] были сгенерированы с помощью скрипта (v1.0.2), установленного из pypi. Экзон-интронные границы были предоставлены в виде файла аннотации гена GTF, загруженного из Ensembl [44] v95. Сценарий предоставляет оценки модели последовательности с эталонным аллелем и с альтернативным аллелем для пяти подмоделей (акцептор, акцепторный интрон, экзон, донор и донорный интрон).Сценарий также предоставляет составные линейные модели delta_logit_psi и патогенность, которые суммируют пять подмоделей в одной метрике. Для сравнения производительности использовались показатели delta_logit_psi.
Предварительно выставленные оценки SpliceAI [41] версии 1.3 были загружены с Illumina BaseSpace. Для более крупных InDels, недоступных из предварительно вычисленных оценок, варианты оценок были рассчитаны с помощью адаптированной версии сценариев SpliceAI версии 1.3 (https://github.com/Illumina/SpliceAI/), которая способна интегрировать оценки из предварительно оцененных файлов, чтобы для более быстрого подсчета очков.При сравнении SpliceAI с другими оценками все четыре модели SpliceAI были объединены в одну оценку с использованием максимальной оценки для варианта.
Комбинированный показатель MMSplice и SpliceAI, MMAI, был определен для оценки набора данных MFASS. Чтобы придать равный вес как MMSplice, так и SpliceAI, баллы были разделены на соответствующее стандартное отклонение для всех вариантов MFASS (MMSplice 0,5291, SpliceAI 0,1206) и добавлены нормализованные баллы. Для SpliceAI использовался максимальный балл по всем подмоделям SpliceAI, а для MMSplice delta_logit_psi.Точно так же MMAIpsi определяли путем включения нормализованного «процента сплайсинга», измеренного для эталонного аллеля в наборе данных MFASS (стандартное отклонение 0,0622 для всех вариантов MFASS).
Мы исследовали «долю, выраженную в транскриптах» (pext) [6] (версия от 27 февраля 2019 г.) в качестве предиктора важности сайта сплайсинга. Значения были загружены с сервера gnomAD и заархивированы для воспроизводимости по адресу https://doi.org/10.5281/zenodo.4447230. Для интронных вариантов используется значение pext ближайшего экзона.
Интеграция функций SpliceAI и MMSplice в CADD
SpliceAI и MMSplice (см. выше) были адаптированы как функции в CADD. Для SpliceAI все четыре подмодели SpliceAI для окон последовательности размером 10 КБ были интегрированы в виде отдельных аннотаций. Как в наборе обучающих данных, так и в окончательной оценке прогнозируемое усиление сплайсинга на аннотированных сайтах сплайсинга и прогнозируемое снижение сплайсинга за пределами аннотированных сайтов сплайсинга были установлены на 0 (для донорных и акцепторных сайтов). Ранее это было описано для SpliceAI [41] и называлось маскированием.Мы полагались на предварительно вычисленные оценки SpliceAI, поскольку оценка всего генома на основе последовательности была слишком затратной с вычислительной точки зрения. Поскольку модели требуют, чтобы эталонная база варианта соответствовала эталону человека, варианты прокси-доброкачественного набора обучающих данных CADD (варианты, полученные от человека) оценивались с реверсированием эталонных и альтернативных аллелей. Чтобы скорректировать это, оценки модели усиления и потери были заменены местами для донора и акцептора, и после замены было применено маскирование, как описано выше.
Для MMSplice все пять подмоделей были интегрированы как отдельные аннотации.MMSplice предоставляет оценки только для вариантов, в которых ссылка соответствует ссылке на геном. В случае прокси-вредного класса смоделированных вариантов, а также в скоринговых приложениях модели CADD эталонная оценка вычиталась из альтернативной оценки, как описано авторами. В прокси-доброкачественном классе альтернативный балл вычитался из эталонного балла. Для всех подмоделей MMSplice положительные различия в оценках были установлены на 0.
Для вариантов, аннотированных несколькими различными предсказаниями последствий, как аннотировано Ensembl VEP, оценки MMSplice и SpliceAI были ограничены следствием одного и того же гена.Все варианты, не аннотированные с помощью MMSplice или SpliceAI, были оценены как 0. Все девять аннотаций MMSplice и подмоделей SpliceAI для окон последовательностей размером 10 kb были дополнительно включены в перекрестную характеристику с аннотацией последствий (см. «Краткое описание моделей CADD v1.6» ниже).
ClinVar патогенных и распространенных вариантов gnomAD
ClinVar [45] был загружен с https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/pub/clinvar/ (20 апреля 2020 г.). «Патогенные» варианты были отобраны из базы данных на основании присвоения «Клиническая значимость варианта», исключая варианты с множественными присвоениями.Варианты gnomAD [46] (версия 2.1.1, 229 миллионов однонуклеотидных вариантов из 15 708 полногеномных секвенированных лиц) были загружены с https://gnomad.broadinstitute.org/. Варианты отфильтровывались на основе фильтров, установленных авторами gnomAD, т.е. учитывались только варианты, прошедшие фильтры качества. Варианты InDel длиной более 50 п.н. не рассматривались. Общие варианты из gnomAD с частотой минорного аллеля (MAF) более 0,05 использовались в качестве «доброкачественного набора» по сравнению с «патогенными» вариантами ClinVar.Чтобы оценить варианты ГРЧ47 с моделями CADD ГРЧ48, варианты были подняты до ГРЧ48 с использованием CrossMap [47], за исключением вариантов, которые не были возвращены к тем же координатам ГРЧ47. 12 из 68 491 патогенных вариантов ClinVar и 2300 из 165 881 распространенных вариантов gnomAD не могли быть реципрокно подняты между сборками генома и были исключены. Типы вариантов были аннотированы с использованием Ensembl VEP [48] и более широких назначений последствий CADD.
Вероятно патогенные ClinVar по сравнению с низкочастотными вариантами gnomAD
SNV из ClinVar (см.Испытывались варианты, которым были присвоены два термина «вероятно-патогенный» и «патогенный»). Мы также решили рассмотреть эти варианты в отдельном наборе тестовых данных, поскольку они реже используются для обучения классификаторов вариантов, что снижает вероятность завышенных оценок производительности. «Вероятно патогенные» варианты сравниваются с 300 000 случайно выбранных SNV из gnomAD (см. выше) с частотой минорных аллелей ниже 0,05 и количеством аллелей выше 1.
Обогащение вариантов gnomAD
см. выше) были отнесены к трем бинам как частые (MAF > 0.001), редкие (MAF < 0,001, количество аллелей> 1) и одиночные (количество аллелей = 1). Для сравнения различных версий CADD в качестве вариантов рангов использовались процентили оценок. Типы вариантов были аннотированы с использованием Ensembl VEP [48] и более широкой категории последствий CADD. Обогащение по категориям рассчитывали как процентили для всех вариантов одной и той же категории и делили количество наблюдаемых вариантов выше этого порога в ячейке на число, ожидаемое при случайном жеребьевке. Для оценки дисперсии было выполнено 1000 итераций начальной загрузки, из которых показан доверительный интервал 95%.
Изменения в CADD с версии 1.4/1.5
Несколько незначительных изменений по сравнению с CADD v1.4/v1.5 были реализованы, как указано в примечаниях к выпуску CADD v1.6 [49]. Это включает в себя исправления аннотаций в версии CADD GRCh48, в частности оценки GERP [50], где было исправлено целочисленное переполнение, и Ensembl Regulatory Build [51], где иерархическое назначение различных категорий элементов было нестабильным, если для каждого варианта сообщалось более одной категории. . Другая проблема, характерная для CADD v1.4/v1.5 был исправлен, где высококонсервативные кодирующие варианты можно было оценить как UTR перекрывающихся аннотаций генов. Кроме того, из уровней категориальных последствий было удалено слово «неизвестно», так как оно включало только два варианта во всей обучающей выборке. Эти варианты (классифицированные VEP как варианты кодирующих последовательностей без дальнейшего уточнения) были повторно отнесены к категории «синонимичных» последствий.
Сводка моделей CADD v1.6
Полный список аннотаций, включенных в CADD-Splice, приведен в дополнительном файле 1: таблица S1 для GRCh47 и в дополнительном файле 1: таблица S2 для GRCh48.Модель CADD-Splice (CADD GRCh47-v1.6) имеет в общей сложности 1029 признаков, полученных из 102 аннотаций. Двести двадцать два объекта X i получены из 90 числовых аннотаций и горячего кодирования 12 категориальных/булевых аннотаций. Четырнадцать булевых индикаторов W i выражают, является ли данный признак/группа признаков (из cDNApos, CDSpos, protPos, aminoacid_substitution, targetScan, mirSVR, Grantham, PolyPhenVal, SIFTval, Dist2Mutation, chromHMM, dbscSNV_ada, dbssc ) не определено.Пары из 12 замен оснований и 189 замен аминокислот, которые можно создать с помощью SNV, соответствуют еще 201 признаку. Кроме того, 16 различных категорий последствий вариантов и набор D , состоящий из 37 аннотаций bStatistic, cDNApos, CDSpos, Dst2Splice, GerpN, GerpS, mamPhCons, mamPhyloP, minDistTSE, minDistTSS, priPhCons, priPhyloP, protPos, relcDNApos, relCDSpos, relProtPos, relProtPos verPhCons, verPhyloP, Dist2Mutation, freq100, freq1000, freq10000, rare100, rare1000, rare10000, sngl100, sngl1000, sngl10000, SpliceAI_accgain, SpliceAI_accloss, SpliceAI_dongain, SpliceAI_donloss, MMSplice_acceptorIntron, MMSplice_acceptor, MMSplice_donorIntron, MMSplice_donor и MMSplice_exon используются для создания набора 592 следствия взаимодействия.{16}{\sum}_{j\in D}{\alpha}_{ij}{\mathbbm{1}}_{\left\{\boldsymbol{i}-\boldsymbol{th}\ \boldsymbol{ Следствие}\ \boldsymbol{category}\right\}}{X}_j $$
Для CADD GRCh48-v1.6 общее количество признаков составляет 1028, полученных из 120 аннотаций. Стратегия оптимизации гиперпараметров не изменилась по сравнению с CADD v1.4 [20]. Полный список наборов данных, использованных для разработки CADD-Splice, представлен в дополнительном файле 1: таблица S3. Более подробная информация об обучении модели (включая скрипт для загрузки матриц данных и обучение scikit-learn) доступна по адресу https://cadd.gs.washington.edu/training.
Редактирование РНК в митохондриальных трансинтронах необходимо для сплайсинга
Abstract
В митохондриях растений экспрессия генов транслируемой мРНК представляет собой сложный процесс, состоящий из двух важных этапов: редактирования РНК и сплайсинга. Мы изучили роль редактирования РНК на некодирующих участках транскрипта mat-r-nad1e-nad5c из митохондрий пшеницы. Эта РНК содержит два транс -интрона, 3′- nad1-I4 и 3′- nad5-I2 , участвующих в различных транс- событиях сплайсинга, обеспечивая ассоциацию nad1d — 1nad1e и nad5b — nad5c экзонов из nad1 и nad5 мРНК соответственно.Изученные здесь изменения редактирования C-to-U влияют на гомологичные положения 3′- nad1-I4 и 3′- nad5-I2 . Предполагается, что эти замены оснований необходимы для того, чтобы поместить остаток аденозина в выпуклую конформацию, характерную для домена VI (D6) из интронов группы II. В этой работе мы исследовали роль событий редактирования РНК на 3′- nad1-I4 и 3′- nad5-I2 в процессе сплайсинга транс с использованием in vivo и в подходах organello .Когда были проанализированы разветвленные интермедиаты, образующиеся в процессе сплайсинга, остатки C из интронных доменов D6 из 3′- nad1-I4 и 3′- nad5-I2 были заменены на U, что позволяет предположить, что редактирование РНК этих остатков может быть обязательным для сплайсинга. Это предположение было проверено путем экспрессии рекомбинантных трансгенов mat-r — nad1e , введенных в митохондрии методом электропорации. Мутация целевого остатка редактирования сильно повлияла на сплайсинг транс .Интересно, что эффективность соединения экзонов не восстанавливалась компенсаторными мутациями, что позволяет предположить, что роль редактирования РНК не ограничивается восстановлением вторичной структуры домена D6 интрона. Наши результаты убедительно подтверждают гипотезу о том, что редактирование РНК в транс- -интронах предшествует созреванию и необходимо для реакции сплайсинга. Кроме того, это первый отчет с использованием подхода in organello для изучения процесса сплайсинга транс , что открывает путь к будущим исследованиям этого своеобразного механизма.
Образец цитирования: Farré JC, Aknin C, Araya A, Castandet B (2012) Редактирование РНК в митохондриальных транс -интронах требуется для сплайсинга. ПЛОС ОДИН 7(12): е52644. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0052644
Редактор: Стефан Маас, NIGMS, Национальный институт здравоохранения, Соединенные Штаты Америки
Поступила в редакцию: 9 октября 2012 г.; Принято: 19 ноября 2012 г.; Опубликовано: 20 декабря 2012 г.
Авторское право: © 2012 Farré et al.Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания оригинального автора и источника.
Финансирование: Это исследование было поддержано Национальным центром научных исследований, Сегаленским университетом Бордо, Франция, и программой PICS-CNRS № 3641. Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, решение о публикации или подготовке рукописи.
Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.
Введение
В митохондриях растений производство стационарного пула мРНК, готовых к трансляции, представляет собой сложный процесс. После инициации транскрипции с нескольких промоторов [1], [2] РНК проходят несколько стадий процессинга, наиболее важными из которых являются редактирование и сплайсинг РНК [3], [4].
РедактированиеРНК происходит за счет специфичного к основанию дезаминирования цитозина в урацил [5].Эти модификации в основном происходят в кодирующих областях и влияют на аминокислотную последовательность белкового продукта [6], [7]. Таким образом, редактирование РНК является важным шагом для обеспечения производства функциональных белков [8], [9]. В то время как роль редактирования РНК в кодирующих областях мРНК легко объясняется влиянием на белковый продукт, его функция в некодирующих областях до сих пор остается спорной.
интронов группы II, которые считаются предками сплайсосомных интронов и ретроэлементов [10], [11], являются преобладающим типом интронов в митохондриях растений [3].Для них характерна вторичная структура, образованная шестью стержне-петлевыми доменами (от D1 до D6), расположенными вокруг центрального колеса, образующего сложную третичную архитектуру [12], [13]. На основании структурных предсказаний предполагается, что редактирование РНК восстанавливает неправильно спаренные остатки в высококонсервативных стеблях [14]–[16]. Аналогичная ситуация недавно была отмечена для интронов I группы митохондрий растений [17]. Эти наблюдения привели к гипотезе, что редактирование РНК в интронах может играть роль в реакции сплайсинга.
Используя модель гетерологичного сплайсинга дрожжей, было высказано предположение, что редактирование РНК является предпосылкой для сплайсинга [18], однако анализы интермедиатов сплайсинга in vivo показали обратное [19]. Недавно Кастандет и др. . сообщили, что редактирование и сплайсинг могут быть связаны посредством модификации единственной замены C-to-U в домене I (D1) интрона мРНК rps10 [20].
Помимо цис -интронов, описанных выше, митохондриальные геномы растений содержат несколько рассеянных генов, требующих транс -сплайсинга для получения трансляционно компетентных мРНК [3].У пшеницы ген nad1 экспрессируется пятью независимыми транскриптами посредством одного цис — и трех транс — сплайсинга [21], а мРНК nad5 генерируется двумя цис -сплайсингом и двумя транс — события сплайсинга из трех независимых транскриптов [22]. Интересно, что один транскрипт, mat-r-nad1e-nad5c, , является общим субстратом для двух разных процессов trans-, обеспечивающих сцепление экзонов nad1d/e и nad5b/c.В обоих случаях интронный разрыв находится в вариабельном домене IV (D4) в канонической вторичной структуре интронов группы II [12].
Предыдущие исследования по изучению экспрессии локуса mat-r-nad1e-nad5c показали две замены C-to-U в домене VI (D6) соответствующих транс--интронов [23], [24] (рис. 1A). ). Хотя область D6 в 3′-области интронов nad1-I4 и nad5-I2 демонстрирует низкую идентичность последовательностей, они могут быть уложены в аналогичную структуру «стебель-петля».Интересно, что оба события редактирования РНК увеличивают стабильность стволовой петли D6, помещая остаток аденозина в выпуклость [24]. Эта конформация характерна для точки лариатного ветвления, которая имеет решающее значение для сплайсинга интронов группы II [25], [26]. 2′-ОН выпирающего аденозина действует как нуклеофил на первой стадии переэтерификации при сплайсинге [27]. Следовательно, разумно предположить, что редактирование РНК в транс -интронах может играть роль в реакции сплайсинга для nad1e и nad5c.
Рис. 1. Котранскрипт mat r-nad1e-nad5c из митохондрий пшеницы.
(A) Схема mat r-nad1e-nad5c РНК и транс -аналогов сплайсинга. Серые квадраты представляют пятый и третий экзоны nad1 и nad5 соответственно на одной и той же молекуле, связанной с ORF матуразы-обратной транскриптазы ( mat-r ) [21], [24]. Синие стрелки указывают остатки, отредактированные в кодирующих областях транскрипта.Красные стрелки указывают на отредактированные остатки в некодирующих областях. Пунктирными линиями показаны места сплайсинга nad1e и nad5c экзонов с nad1d и nad5b экзонов. (B) Домен 6 обоих, nad1-I4 и nad5-I2, группы II транс -интронов изображен в виде структуры «стебель-петля». Наиболее стабильные конформации представлены для неотредактированной и отредактированной мРНК. Красная стрелка указывает на отредактированный остаток.
https://дои.org/10.1371/journal.pone.0052644.g001
До сих пор не сообщалось об автокаталитическом процессинге интронов группы II из растительных митохондрий, что позволяет предположить, что эти элементы эволюционировали с помощью белкового способа созревания РНК. Недавние данные показали, что несколько белков семейства генов PPR участвуют в сплайсинге митохондриальной РНК растений [28]–[30]. Эта ситуация затрудняет изучение роли интронных структурных элементов в процессе сплайсинга. Чтобы обойти эту проблему, мы ввели nad1e -содержащих генных конструкций в изолированные митохондрии методом электропорации [31].Этот подход позволяет нам изучить роль редактирования РНК на интроне nad1-I4 . Здесь мы впервые показываем статус редактирования этих некодирующих остатков в интермедиатах сплайсинга и изучаем судьбу трансгена, несущего экзон nad1e в реакции trans -сплайсинга с эндогенными партнерами nad1 . Наши результаты убедительно подтверждают гипотезу о том, что редактирование РНК в транс-интронах участвует в реакции сплайсинга.
Материалы и методы.AF337547). Эта область является мишенью для специфического праймирования химерных продуктов сплайсинга в ПЦР-анализе. Мутанты были получены с помощью набора для направленного мутагенеза QuickChange® (Stratagene) в условиях, указанных поставщиком. Фрагменты рестрикции и продукты ОТ-ПЦР очищали с помощью набора GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare). Продукты ПЦР клонировали в вектор pGEM-T (Promega) с использованием метода клонирования ТА.
Сборка
nad1e Конструкции, используемые для экспериментов по электропорации Геномную ДНК пшеницыиспользовали в качестве матрицы для получения области, содержащей либо полную ORF mat-r ( Mat1 ), либо С-концевой домен Dx ( SDx1 ), связанный с экзоном nad1e с помощью ПЦР. .Mat1 был получен с использованием праймеров Sac-MatR, объединенных с SmaI-ex5nad1, и SDx1 был амплифицирован с помощью ПЦР с использованием праймеров Sac-Dx, объединенных с Spe-ex5nad1 (см. файл S1). Продукты ПЦР очищали с использованием геля Wizard® SV и системы очистки ПЦР (Promega). Подробности об областях локуса mat-r-nad1e-nad5c , используемых в конструкциях, указаны в файле S2.
продукта ПЦР инкубировали с эндонуклеазами Sac1 и Sma1 для получения конструкции Mat1 и с эндонуклеазами SacI и SpeI для конструкции SDx1.Продукты ПЦР лигировали с вектором pCOX2Ta [31], расщепленным теми же ферментами. Расщепление Sac1 вектора pCOX2Ta приводит к потере cox2 в рекомбинантной плазмиде. Для получения конструкций с промотором cox2 выше последовательностей Mat1 или SDx1 использовали праймеры для ПЦР Nsi-MatR и Nsi-Dx с праймерами SmaI-ex5nad1 и Spe-ex5nad1 соответственно. Продукты ПЦР расщепляли Nsi1 и Sma1 или Nsi1 и Sac1 и лигировали с вектором pCOX2Ta, расщепленным теми же ферментами.Используемая стратегия генерирует ген Dx , продуцирующий транскрипт с 52 дополнительными остатками в 3′-некодирующей области, связывающий nad1e с последовательностью терминатора IR-cob по сравнению с РНК из Mat1.
Очистка митохондрий
митохондрий пшеницы готовили, как описано ранее [31]. Митохондрии, очищенные центрифугированием в градиенте сахарозы, ресуспендировали в 0,33 М сахарозе. Содержание белка определяли с помощью анализа белка Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Inc.), доводили до концентрации 20 мг/мл и сразу использовали в экспериментах по электропорации.
Электропорация митохондрий
Для электропорации использовали 1 мг митохондриальных белков и 2 мкг рекомбинантной плазмиды [31]. После импульсной электропорации митохондрии инкубировали в течение 18 ч при 25°С при постоянном встряхивании (130 об/мин) в реакционной смеси, содержащей 0,33 М маннита, 90 мМ KCl, 10 мМ MgCl 2 , 12 мМ трицина (рН 7,2), 5 мМ KH 2 PO 4 , 1.2 мМ EGTA, 10 мМ сукцината натрия, 1 мМ GTP, 2 мМ АДФ, 0,15 мМ CTP и 0,15 мМ UTP, 2 мМ дитиотреитола и 1 мг/мл BSA, не содержащего жирных кислот. Митохондрии извлекали центрифугированием при 15000×g в течение 15 мин при 4°С. РНК очищали путем экстракции 800 мкл реагента Trizol® (Invitrogen) в соответствии с протоколом поставщика.
ОТ-ПЦР
Выделение и амплификация трансгенной РНК: 1 микрограмм нуклеиновых кислот, полученных после обработки тризолом® электропорированных митохондрий, расщепляли 2 ед. ДНКазы I степени амплификации (Invitrogen) в течение 15 мин при 25°C.Синтез кДНК проводили с использованием 200 единиц Superscript II RT (Invitrogen) с использованием 100 нг случайных гексамеров (Promega). ПЦР-амплификацию проводили со смесью полимераз Advantage 2 (Clontech) с использованием праймеров, специфичных к гену пшеницы cob ( Ir-cob ) и к эндогенному транскрипту nad1 . Используемые параметры ПЦР: 95°С в течение 2 мин, 20 циклов при 95°С в течение 30 с, 64°С в течение 1 мин и 68°С в течение 2 мин и, наконец, 68°С в течение 10 мин. При необходимости 2 мкл этого продукта ПЦР затем использовали в двух последующих вложенных реакциях ПЦР с теми же параметрами, за исключением температуры отжига: 55°С и 51°С для ПЦР 2 и 3 соответственно.
Выделение и амплификация разветвленных промежуточных продуктов: очистку РНК и синтез кДНК проводили, как описано выше. Обратную транскрипцию выполняли с использованием специфических праймеров P1a или P1b, комплементарных 5′-области интронов, связанных с экзонами nad1d и nad5b соответственно (рис. 2А и 3А). Праймеры P2a и P2b использовали для гнездовой ПЦР на 2 мкл кДНК в сочетании с праймерами P3a или P3b. В обоих случаях праймеры Р1 и Р2 направляют синтез ДНК к 5′-концу полутранскрипта, в то время как праймеры Р3, комплементарные смысловой цепи, инициируют синтез ДНК в расходящемся направлении.Более того, сайты связывания праймеров Р2 и Р3 находятся на отдельных молекулах. Следовательно, P2 в сочетании с праймерами P3 не генерируют продукты ПЦР на мтДНК или кДНК, а только на разветвленных молекулах. Праймеры P2 и P3 были разработаны для получения короткого продукта ПЦР длиной около 130 п.н. для обоих промежуточных продуктов. Подробная информация об используемых праймерах указана в файле S1. В этом исследовании использовались только препараты РНК, не содержащие ДНК. Контроль выполняли с помощью амплификации ПЦР на контрольных образцах без обратной транскриптазы.
Рис. 2. Редактирование РНК в транс-сплайсинге nad1e разветвленных молекул.
(A) Схема разветвленного интермедиата сплайсинга, образующегося во время транс--сплайсинга. Положение праймеров, используемых для выделения промежуточного продукта сплайсинга, указано красными и черными стрелками. Пунктирные линии указывают на нуклеофильную атаку 2’OH из выпуклого A домена D6 с получением 2′-5′-разветвленного промежуточного соединения (B) Гель-электрофорез продуктов ПЦР, полученных путем объединения праймеров P2a и P3a ( nad1d/e ).Последовательность праймеров, использованных для выделения промежуточных продуктов сплайсинга nad1e и nad5c , указана в файле S1. Показаны электрофореграммы выбранного клонированного продукта ПЦР. Красные стрелки указывают на отредактированный U, полученный преобразованием остатка C, кодируемого геномом. Звездочка указывает на остаток А в точке ветвления; этот остаток отсутствует на электрофореграмме последовательности. M, маркеры молекулярной массы PhiX174 DNA/HaeIII (Promega).
https://дои.org/10.1371/journal.pone.0052644.g002
Количественная оценка сплайсинга РНК
продукта ОТ-ПЦР разделяли на агарозном геле, содержащем гель-краситель ДНК SYBR®Safe (Invitrogen), и проводили в стандартных условиях электрофореза. Эффективность сплайсинга определяли по флуоресценции SYBR Safe, интеркалированного в ДНК, полученной из молекул-предшественников и зрелых молекул, с использованием камеры CCD, соединенной с ПК. Полученные изображения сканировали с помощью программного обеспечения ImageJ64 (http://rsb.info.nih.gov/ij/).
Количественная оценка редактирования РНК
Для определения профиля и скорости превращения C в U в продуктах ОТ-ПЦР полосы предшественника и зрелой ПЦР вырезали из агарозного геля после разделения электрофорезом. Полосы очищали с помощью набора GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare). Очищенные фрагменты лигировали в вектор pGEM-T easy, как описано производителем (Promega). Клонированные продукты ПЦР секвенировали с помощью набора BigDye® Terminator Cycle Sequencing Kit v 1.1 (Прикладные биосистемы). Анализы последовательностей были выполнены в Центре генотипирования и секвенирования Университета Виктора Сегалена-Бордо 2.
Результаты
Разветвленные промежуточные соединения из
nad1d/e и nad5b/c транс -сплайсинга представляют остаток C-мишени, отредактированный в UИзменение C-на-U как nad1e-I4 , так и nad5c-I2 транс -интронов в ко-транскрипте mat-r-nad1e-nad5c может повлиять на структуру D6 ствол-петля интронов ( Фигура 1).Котранскрипт является субстратом двух отдельных транс событий сплайсинга, позволяющих установить связь между nad1d с nad1e экзонами и nad5b с nad5c экзонами. Чтобы оценить, является ли это редактирование РНК необходимым условием для сплайсинга, мы проанализировали разветвленные структуры nad1d-nad1e и nad5b — nad5c , полученные в результате первой реакции переэтерификации. Используемая стратегия показана на рисунках 2А и 3А и подробно описана в разделе «Методы».Только ковалентно разветвленные молекулы, полученные после первых стадий переэтерификации во время сплайсинга, генерировали продукт ПЦР с использованием этого подхода. Комбинируя праймеры P2 и P3, был получен продукт ПЦР размером около 130 п.н., соответствующий разветвленным молекулам (фиг. 2B), что указывает на присутствие транс--промежуточных соединений сплайсинга в стационарном пуле РНК. Аналогичные Y-образные промежуточные продукты, полученные в результате процесса сплайсинга nad5b/nad5c , были получены с использованием аналогичных праймеров P1b, P2b и P3b (не показаны) и с праймером P2b в сочетании с праймерами P4 или P5 (фиг. 3A.Используемые праймеры подробно описаны в файле S1. Идентичность продуктов ПЦР была подтверждена анализом последовательности, показывающим, что короткие молекулы ПЦР связывают обе половины транс-интрона с помощью предсказанной 2′-5′ фосфодиэфирной связи в выпуклости A (отсутствует на электрофореграммах) (рис. 2B и 3C). ).
Рис. 3. Редактирование РНК в транс-сплайсинге nad5c разветвленных молекул.
(A) Схема транскриптов nad5b и mat-r-nad1e — nad5c .Размер прямоугольников не отражает фактический размер экзонов. Праймеры, используемые для промежуточного анализа разветвленного сплайсинга, обозначены стрелками. (B) Анализ электрофореза в агарозном геле продуктов RT-PCR из разветвленной структуры nad5c . кДНК синтезировали с праймером P1b с последующей ПЦР-амплификацией с использованием праймеров P2b и P4 (дорожка 1) или праймеров P2b и P5 (дорожка 2). Праймер P4 специфичен в отношении домена Dx матуразы, а P5 специфичен в отношении экзона nad1e .М, маркеры молекулярной массы. (C) Показаны отдельные части электрофореграммы клонированного продукта ПЦР размером 1,5 т.п.н. Последовательность, начинающаяся с домена матуразы Dx и начала 3′-половины интрона nad1-I4 (верхняя панель), конца 3′-половины интрона nad1e и экзона nad1e (средняя показана панель) и разветвленный промежуточный продукт сплайсинга nad5c (нижняя панель). Красные стрелки показывают положение отредактированных остатков.
https://дои.org/10.1371/journal.pone.0052644.g003
Для проверки статуса редактирования мишени C, расположенной на два остатка выше точки ветвления в области D6, продукты ПЦР клонировали и секвенировали. Все проанализированные разветвленные молекулы (24 клона nad1e и 36 клонов nad5c ) представляли остаток U в сайте редактирования D6 (таблица 1). Точно так же статус редактирования обоих остатков C в предшественнике mat-r-nad1e-nad5c анализировали с использованием праймеров P4 и P6 (см. Фигуру 3A).В отличие от разветвленных промежуточных продуктов, только около половины проанализированных клонов были отредактированы по С-целевому остатку D6 (таблица 1). Отметим, что в некоторых клонах были обнаружены короткие вставки от 3 до 8 нуклеотидов после точки ветвления, событие, описанное ранее [32]–[34], что указывает на некоторую неточность на первом этапе переэтерификации. Тем не менее, все эти молекулы также имели отредактированную C-мишень D6.
Экзон
nad5c может участвовать в сплайсинге без потери сопутствующего домена mat-r Dx и экзона nad1eЧтобы проверить, являются ли экзоны nad5c и nad1e, , экспрессируемые в одном и том же транскрипте, общим субстратом для двух различных реакций транс -сплайсинга, мы проанализировали присутствие обоих экзонов в разветвленном промежуточном продукте сплайсинга nad5c .Для этой цели проводили ПЦР-амплификацию кДНК, синтезированной с праймером P1b, с использованием праймеров P2b и либо P4, либо P5. Праймеры P4 и P5 расположены на С-концевом участке ORF mat-r (Dx) и экзоне nad1e соответственно (рис. 3А). Мы наблюдали ожидаемые продукты размером 1523 и 663 п.н. (рис. 3B), что указывает на то, что первая стадия переэтерификации, связывающая экзон nad5b с nad5c , может происходить до сплайсинга экзонов nad1d/e .Продукт ПЦР, полученный с P2b и P4, показывает статус редактирования обеих областей D6 на одной и той же молекуле в одном прогоне последовательности. Части разветвленной промежуточной последовательности из продукта ПЦР размером 1,5 т.п.н. показаны на фиг.3С. Во всех проанализированных образцах nad1-I4 и nad5-I2 остатков D6 C были заменены на U. Кроме того, сайты редактирования, обнаруженные в кодирующих областях, шесть в домене Dx и девять в экзоне nad1e [24], также были отредактировано, что указывает на то, что этот процесс происходит ранее или сопутствует процессингу РНК.
Трансген
nad1e является субстратом для транс-сплайсинга в электропорированных митохондрияхЧтобы проверить, играет ли редактирование РНК роль в процессе сплайсинга trans-, мы вводили сконструированные конструкции matr-nad1e в изолированные митохондрии с помощью электропорации [31]. На основании предыдущих наблюдений, указывающих на присутствие внутреннего промотора в ORF mat-r [24], для использования в экспериментах по электропорации были разработаны четыре различные конструкции (рис. 4А).Два из них содержат либо полную ORF mat-r ( Mat1 ), либо только матуразный домен ( Dx1 ), а два других, coxMat1 и coxDx1 , содержат дополнительный промотор cox2 [3]. Экспрессия в organello всех четырех конструкций давала химерный ген (см. файл S3). Конструкции, лишенные промотора cox2 , демонстрировали детектируемые продукты транскрипта, что указывает на то, что внутренний промотор из mat-r [24] является функциональным (фиг. 4, дорожки Mat1 и Dx1 ).
Рис. 4. В organello транс -сплайсинг после электропорации nad1e рекомбинантных векторов.
(A) Четыре единицы транскрипции, необходимые для сборки мРНК nad1 в митохондриях пшеницы [21], указаны в верхней части панели A (экзоны nad1 a, b, c, d и e представлены ящики). Четыре химерных трансгенных конструкции nad1e , Mat1 , содержащие всю 3′-половину интрона 4 ( 3 ‘ nad1-I4 ) и nad1e экзон, Dx85 домен, содержащий только домен maturase ORF из mat-r были связаны с инвертированным повтором (двойной стержень-петля) из некодирующей области гена апоцитохрома b пшеницы ( Ir-cob) .Эти конструкции сливали с промотором субъединицы 2 цитохромоксидазы ( cox2 ) с получением рекомбинантных векторов coxMat1 и cox2Dx1 . Стрелки указывают на специфический экзон и cob праймеры, используемые в анализах электропорации транс -сплайсинга. (B) Электрофорез в агарозном геле продуктов RT-PCR, полученных с праймером cob в сочетании с праймерами, расположенными либо в экзонах nad1b (Pb) , либо в nad1c (Pc). Положение праймеров для ПЦР указано стрелками.М, маркер молекулярной массы. Различные конструкции различаются по восходящим последовательностям от экзона nad1e .
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0052644.g004
Поскольку экспрессия двух разных векторов, несущих транс -партнерские гены сплайсинга в одном компартменте, затруднена из-за отсутствия давления отбора, мы исследовали сплайсинг трансгенных РНК с родственными эндогенными транскриптами. Реакции ПЦР проводили с использованием праймера cob в сочетании с праймерами, расположенными либо в экзоне nad1a (Pa), nad1b (Pb), либо nad1c (Pc) (см. файл S1 и рисунок 4A).Все конструкции генерировали химерные продукты сплайсинга, содержащие nad1b , nad1c и nad1d экзонов, связанных с nad1e (фиг. 4B). Продукт амплификации не был обнаружен при использовании праймера, расположенного на экзоне nad1a . Анализ последовательности различных продуктов ПЦР показал, что полосы, наблюдаемые в гелях для электрофореза, соответствуют добросовестным продуктам сплайсинга из nad1e , содержащих трансген. Стыки между экзонами nad1b — c — d — e сопоставимы с эндогенной мРНК (файл S4), что указывает на то, что трансгенный транскрипт был успешно включен в процессированный пул РНК.
Статус редактирования трансгенного
nad1e Экзонпревращения C-в-U, полученные путем редактирования РНК сплайсированных транскриптов, полученных в результате электропорации трангена Dx1 , оценивали путем секвенирования 30 отдельных ПЦР-клонов. Эффективность редактирования определяли как процент остатков Т, обнаруженных на месте конкретных геномных остатков С в продуктах ПЦР (рис. 5). Девять сайтов редактирования обнаружены в экзоне nad1e [24], а четыре, один, девять и одна мишень редактирования Cs присутствуют в экзонах a, b, c и d соответственно [21].Все сайты редактирования на экзонах nad1b , nad1c и nad1d заменены на U, в то время как экзон nad1e демонстрирует переменный уровень редактирования. Более 60% клонов редактировались в сайтах С734, С743, С779 и С825, наиболее близких к экзону d, тогда как пять 3′-дистальных С-мишеней (после С835) редактировались менее эффективно. Экзон nad1e полностью редактируется в зрелой эндогенной мРНК nad1 в псевдоэлектропорированных митохондриях.
Рисунок 5.Уровни редактирования РНК в сплайсированном химерном транскрипте nad1 .
Конструкцию SDx электропорировали в изолированные митохондрии, как описано в разделе «Материалы и методы». После 18-часовой инкубации мтРНК выделяли и химерные продукты сплайсинга получали с помощью ОТ-ПЦР с использованием праймеров, расположенных в экзоне nad1b и терминаторе cob . Продукт ПЦР, встроенный в вектор pGEM-T, клонировали и секвенировали. Уровни редактирования C-мишеней в экзонах с nad1b по nad1e представляют собой среднее значение для 29 независимых клонов (серые столбцы).Положения С-мишеней в зрелом транскрипте nad1 с учетом первого нуклеотида начального кодона ATG из экзона nad1a, указаны ниже столбцов.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0052644.g005
Мутация остатков редактирования мишени D6 влияет на сплайсинг
Чтобы проверить, важно ли изменение в редактировании С-остатка на стебле D6 предшественника nad1e для сплайсинга, мишень С была изменена на А (SDxA).Также была получена другая конструкция, в которой партнерский остаток в комплементарной области был заменен на Т (SDxRv), а также комбинация обеих модификаций в одной конструкции (SDxDb). Как показано на рисунке 6A, мутанты SDxA и SDxRv предотвращают образование предполагаемой структуры «стебель-петля», в то время как двойной мутант (SDxDb) восстанавливает способность пары оснований в этом положении. Чтобы гарантировать, что эксперименты по электропорации позволяют провести надежное сравнение между различными конструкциями, эндогенные уровни мРНК atp9 использовали в качестве контроля качества кДНК (рис. 6B, нижняя панель).За исключением эндогенной кДНК atp9 (праймеры atp9F и atp9R), сигнал ПЦР не был обнаружен на кДНК из митохондрий, подвергнутых электропорации в отсутствие ДНК (рис. 6B, нижняя панель) при использовании специфических трансгенных праймеров nad1 (файл S1). Продукты сплайсинга анализировали с помощью трех раундов гнездовой ПЦР с использованием праймеров Pc1, Pc2 и Pd1 в сочетании с cob3′(1)AS, cob3′(2)AS и cob3′(3)AS в течение 20 циклов. Мутация C в A (SDxA) сильно снижала сплайсинг по сравнению с конструкцией SDx дикого типа, хотя некоторый продукт все еще можно обнаружить (фиг. 6B, средняя панель).Денситометрический анализ изображений показывает, что менее 1% продукта сплайсинга было произведено мутантами на основе трех независимых экспериментов. Более сильное снижение эффективности сплайсинга наблюдалось для мутанта SDxRv, указывая на то, что противоположный остаток на комплементарной цепи также важен для сплайсинга транс- из nad1e . Чтобы исследовать, является ли ингибирование результатом неспособности обеспечить образование пары оснований, стабилизирующих петлю-стебель D6, использовали двойной мутант (SDxDb).В этом случае эффективность сплайсинга не восстанавливалась до уровней, подобных дикому типу, но была обнаружена слабая полоса, подобная полосе, полученной с использованием конструкции SDxA. Уровни транскриптов-предшественников, генерируемых введенным геном, анализировали с использованием праймеров cob3′(1)AS, cob3′(2)AS в сочетании с Dx1S и Dx2S соответственно в качестве индикатора экспрессии трансгена. Мы обнаружили, что все конструкции были экспрессированы на сопоставимых уровнях (рис. 6В, верхняя панель), что указывает на то, что различное количество продуктов сплайсинга является результатом модификации способности сплайсинга мутантных конструкций.Предшественник и транс--сплайсированная кДНК соответствуют подлинным продуктам трансгенного транскрипта, что подтверждено анализом последовательности.
. Рис. 6. Уровни экспрессии химерных мутантов nad1e .
(A) Предполагаемая шпилечная структура домена D6 из nad1e транс -интрона в конструкциях, использованных в этих экспериментах. Представлены отредактированная версия области D6 (SDxwt) и мутанты SDxA, SDxRv и SDxDb. Стрелка указывает положение редактируемого остатка C-мишени в транскрипте-предшественнике.Красными буквами обозначены остатки, модифицированные в конструкциях. (B) Электрофорез в агарозном геле продуктов ПЦР из транс — сплайсинг nad1 . Введенный ген содержит экзон nad1e и 3′-половину интрона под контролем митохондриального промотора cox2 (подробнее см. Материалы и методы). На верхней панели показан продукт ПЦР из молекул кДНК-предшественников. На средней панели показаны транс — сплайсированные экзоны nad1c / nad1d , связанные с рекомбинантным экзоном nad1e .На нижней панели показаны продукты ПЦР эндогенных транскриптов atp9 в качестве контроля препаратов РНК из электропорированных митохондрий. Для дальнейшего анализа использовали только образцы РНК, в которых ПЦР-анализ не показал загрязнения ДНК. На кДНК из нетрансформированных митохондрий с использованием праймеров, специфичных для анализа транс-сплайсинга nad1 , продуктов амплификации не наблюдалось. Используемые праймеры подробно описаны в файле S1. Сигнал в гелях соответствует одному ( atp9 ), двум (предшественник nad1e ) или трем ( транс — продукт сплайсинга) раундам из 20 циклов ПЦР.Последовательность предшественников и сплайсированных продуктов ПЦР определяли после очистки из геля.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0052644.g006
Обсуждение
Редактирование РНК можно обнаружить в различных структурных доменах митохондриальных интронов, но не все модификации связаны с процессом сплайсинга [3], [14], [15], [19]. Сплайсинг интронов группы II включает две последовательные реакции переэтерификации. Первый представляет собой нуклеофильную атаку 2′-ОН выпуклого остатка аденозина D6 на 5′-соединение сплайсинга, высвобождая 5′-экзон и генерируя разветвленное промежуточное соединение интрон-3′-экзон.Вторая реакция включает нуклеофильную атаку 3′-сайта сплайсинга 3′-ОН последнего нуклеотида 5′-экзона с образованием лигированных экзонов и лариата интронной РНК с 2’–5′-фосфодиэфирной связью в качестве основной. продукты сплайсинга [12], [35]. Наличие изменений C-to-U в D6 как на nad1e-I4 , так и на nad5c-I2 транс -интронах из ко-транскрипта mat-r-nad1e-nad5c поднимает вопрос о функциональном значении редактирования РНК в некодирующих областях.Вторичная структура интрона D6 как в nad1-I4 , так и в nad5-I2 аналогична, хотя и отличается первичной структурой после редактирования (см. рис. 1B). Предсказано, что оба они примут каноническую двумерную структуру «петля-стебель» с остатком аденозина в выпуклости, образующей точку ветвления во время первой стадии переэтерификации [12], [27].
Чтобы оценить, необходимы ли события редактирования доменов D6 nad1e-I4 и nad5c-I2 для транс--сплайсинга как nad1e , так и nad5c , мы проанализировали разветвленные молекулы, полученные в результате сплайсинга 2 и 3).Этот подход позволяет амплифицировать два типа разветвленных молекул: (1) разветвленное промежуточное соединение, в котором еще не произошла вторая стадия переэтерификации, и (2) полностью вырезанные интроны. Интересно, что исследование последовательности области D6 показало, что все разветвленные продукты представлены остатком U в целевом сайте редактирования, в то время как РНК-предшественники показывают смешанный пул транскриптов с остатком C или U (таблица 1). Сильная предвзятость в отношении редактирования остатков C в D6 в промежуточных молекулах подтверждает гипотезу о том, что редактирование этих остатков было необходимо для инициации стадии переэтерификации, что привело к соединению nad1d/nad1e и nad5b/nad5c экзонов.Анализ котранскрипта mat-r-nad1e-nad5c , предложенного в качестве субстрата для транс -сплайсинга экзонов nad1d/nad1e и nad5b/nad5c , дает возможность исследовать предполагаемые промежуточные продукты сплайсинга. Разветвленные продукты nad5c-I2 демонстрируют присутствие домена Dx из mat-r и экзона nad1e (рис. 3), указывая на то, что вырезание транс-интрона nad1e-I4 не требуется для сплайсинг nad5c и предполагает, что процесс trans -сплайсинга происходит, вероятно, случайным образом для обоих, nad1e и nad5c экзонов.Все эти разветвленные молекулы представляют C-мишени редактирования nad5c-I2 и nad1e-I4 , измененные на U.
Мы также заметили, что в некоторых случаях разветвленные интермедиаты сплайсинга nad1e и nad5c содержат от 3 до 8 дополнительных остатков ниже точки ветвления (не показано). Эти результаты согласуются с наблюдениями, сделанными Ли-Пук-Таном и Боненом [33]. В наших условиях анализа мы не обнаружили молекул, представляющих случайный неправильный сплайсинг с различными областями транскрипта.
Для изучения роли редактирования РНК домена D6 из 3′- nad1-I4 в процессе сплайсинга транс сконструированные трансгенов mat-r-nad1e были электропорированы в митохондрии [36], [37]. Трансгенный продукт из химерной конструкции, содержащей экзон nad1e , помеченный областью IR-cob , был точно сплайсирован с их эндогенными аналогами nad1b, nad1c и nad1d (рис. 4, рис. 6 и файл S4).В отличие от стабильного состояния эндогенной мРНК, мы не можем наблюдать химерный мессенджер, включающий экзон nad1a . В представленной здесь модели химерная конструкция экспрессируется в течение восемнадцати часов после электропорации по сравнению с эндогенным пулом РНК nad1 в стационарном состоянии, уже присутствующим в изолированных митохондриях. Было высказано предположение, что созревание функциональной мРНК посредством транс -сплайсинга может зависеть от специфического порядка комбинации экзонов у пшеницы nad5 [38].Одна возможность состоит в том, что nad1a является последним собранным экзоном, но мы не можем отбросить тот факт, что он менее эффективно сплайсируется в используемых экспериментальных условиях.
Как уже упоминалось, in vivo, все проанализированные разветвленные молекулы представляли собой мишень редактирования D6, измененную на U. Хотя точная вторичная структура доменов nad1e и nad5c D6 еще предстоит определить, петлевая структура nad1e и nad5c доменов D6 (рис. 1B) является лучшей, основанной на сходстве с областью D6 из других интронов группы II [25].Предполагается, что выпуклый аденозин, служащий точкой ветвления во время сплайсинга, образуется в 3′-половине интронов nad1e-I4 и nad5c-I2 после C-to-U редактирования. Чтобы предотвратить реорганизацию стержня-петли D6, мы заменили остаток C D6 на A, нередактируемый остаток, что привело к резкому сокращению, но не полному исчезновению -транс--сплайсинга (рис. 6B). Точно так же сильное снижение уровня сплайсинга наблюдалось у мутанта, у которого комплементарное основание А на стебле было заменено на U (рис. 6А, В).Резкое снижение транс--сплайсинга в результате модификаций последовательности D6 было результатом неэффективного сплайсинга, а не неэффективной транскрипции, поскольку экспрессия трансгенного предшественника была одинаковой для каждой мутации и контроля дикого типа. Неожиданно мы обнаружили, что восстановление способности мутантного остатка A к спариванию оснований путем замены комплементарного A на U (рис. 6, дорожка SDxDb) не восстанавливает сплайсинг и остается ниже 1% эффективности сплайсинга дикого типа.
Хотя эти результаты указывают на важность остатка D6 C, низкие уровни сплайсинга транс , обнаруженные в мутантных конструкциях, указывают на то, что в условиях эксперимента неэффективное созревание транскрипта nad1e может происходить без предполагаемых изменений в стебель-петля D6. Это отличается от предыдущих результатов, когда искусственное восстановление способности к спариванию оснований в доменах D1 или D6 цис- интронов восстанавливает способность к сплайсингу [20], [39].Сообщалось, что подавление сайта ветвления D6 в интроне самосплайсинга не препятствует сплайсингу, потому что первая стадия гидролитическая, а не переэтерификация [40]-[42]. Почему митохондрии выбрали путь переэтерификации, который включает события редактирования РНК на D6 интрона вместо механизма гидролиза, остается неизвестным. Можно утверждать, что две стадии переэтерификации происходят как скоординированный процесс, что делает его более эффективным, чем гидролиз с последующей переэтерификацией свободного экзона.
Контакты между остатками, стабилизирующими третичную структуру РНК, также играют важную роль в сплайсинге. Сообщалось, что домен 5 (D5) интрона способствует реакции -транс--сплайсинга [43]. Более того, предполагается, что домен D6 существует в виде двух функциональных конформаций, одна из которых участвует в ветвлении, а другая молчащая конформация, которая стабилизируется η-η’-взаимодействием между D6 и D2 [44], [45]. Однако детали механизмов, участвующих в этих процессах, до сих пор являются предметом дискуссий [25], [35].Предполагается, что третичный контакт остатков домена VI, окружающих точку ветвления, с субдоменом IC1 из домена I (D1) может влиять на ветвление, а не на реакцию гидролиза [25], [46], [47]. Основываясь на этих наблюдениях, одна из возможностей состоит в том, что неспособность транскриптов SDxDb к сплайсингу может быть объяснена тем фактом, что остаток C взаимодействует с рецепторным участком D1. Другая возможность заключается в том, что белковые факторы, помогающие сплайсингу в сочетании с интронными мутациями, могут влиять на некоторые взаимодействия белок-РНК, действуя в этом подходе in organello , поскольку предполагаемые белковые факторы уже присутствуют в электропорированных митохондриях.В нашей модели транскрипт nad1e-nad5c связан с ORF mat-r [23]. Было высказано предположение, что интрон-кодируемый матуразный белок из интронов бактериальной группы IIC может контролировать судьбу и динамику D6, который не может подвергаться ветвлению in vitro в отсутствие матуразы, сплайсинг исключительно посредством гидролитического пути [48], [48]. 49]. Однако точная роль предполагаемого MAT-R в созревании митохондриальной РНК, если таковая имеется, не выяснена.
Одновременно с исследованием редактирования РНК подход in organello позволяет нам проверить вопрос, поднятый анализом стационарного пула РНК mat-r-nad1e-nad5c [24]. В митохондриях были обнаружены два транскрипта, несущие как nad1e , так и nad5c экзонов: один связан с полной ORF mat-r , а другой, более распространенный, содержит 3′-Dx-домен из mat-r [24]. Предполагается, что второй происходит от внутреннего промотора, расположенного между доменами RT и матуразы Dx.Мы подтвердили эту модель, поскольку трансгены, лишенные промотора cox2 , достоверно экспрессируют мРНК nad1e (рис. 4).
Это исследование показывает, что, по крайней мере, для транскриптов mat-r-nad1e-nad5 редактирование важно как для транс -событий сплайсинга, учитывая сильное смещение для U-редактируемого остатка в области D6 промежуточных соединений. Кроме того, эта работа продемонстрировала возможность использования митохондриальной электропорации для изучения транс--сплайсинга для решения различных вопросов, труднодоступных для других подходов.Действительно, схема редактирования и сплайсинговые соединения трансгенных продуктов показывают, что мы получили добросовестных зрелых продуктов из трансгенных конструкций (рис. 5 и файл S4), открывая путь к раскрытию проблем, возникающих в связи с этим сложным способом экспрессии.
При совместном рассмотрении наши результаты показывают, что интроны группы II в митохондриях растений используют различные стратегии, чтобы способствовать сплайсингу, и подтверждают гипотезу о том, что редактирование РНК вносит вклад в структуру РНК, поддающуюся сплайсингу.
Интересно, что редактирование РНК является очень частым процессом в некодирующих областях у млекопитающих [50], [51] и недавно редактирование РНК внутри интрона было вовлечено в регуляцию альтернативного цис -сплайсинга [52]. Кроме того, -транс--сплайсинг описан также в клетках млекопитающих [53], но участие редактирования РНК в этом процессе еще предстоит выяснить.
Вспомогательная информация
Файл S2.
Triticum AESTIVUM митохондриальной НАДН-дегидрогеназы субъединицей I ( nad1 ) и субъединица 5 ( nad5 ) гены, участвующие в транс -splicing.(A) Митохондриальный ген NADH пшеницы nad1 , экзон 4 (ACCESSION X57966) и единица транскрипта для mat-r-nad1e-nad5c (ACCESSION X57965. (Chapdelaine and Bonen (1991) Cell 65∶465–472). Подчеркнута 3′-половина nad1-I4 транс -интрона, содержащая рамку считывания Maturase-Reverse Transcriptase (mat-r) (2134 н.), нижняя часть (серые буквы) образована 3′-половиной nad5- Интрон I2 , экзон nad5c и 5′-половина интрона nad5-I3 .Положение праймеров (P1a, P1b, P2a, P2b, P3a и P3b), используемых для анализа разветвленных промежуточных соединений сплайсинга, выделено синим цветом. Области экзонов обозначены красными ( nad1d и nad5e ) или черными ( nad5c ) прописными буквами. Цели C-редактирования во всей последовательности обозначены красными строчными буквами. Десять нуклеотидов, выделенные жирным курсивом с подчеркиванием (выделены желтым цветом), указывают пределы последовательностей из ко-транскрипта, используемых для рекомбинантных Mat1, , Dx1 и их производных, используемых в экспериментах по электропорации.Подробности процедуры сборки описаны в разделе «Методы». (B) Последовательность гена пшеницы nad5 рассеянный ген ( GenBank: AH001278) ( Pereira de Souza et al. Plant Cell 3 (12), 1363–1378 (1991). Только часть транскрипта, содержащая экзоны nad5a и nad5b . Нижняя область от nad5b, , содержащая 5′-половину транс -интрона nad5-I2, , является частью ко-транскрипта nad5-I2, . -nad5c (см. выше).Положения праймеров P1b и P2B, использованных для анализа промежуточного продукта разветвленного сплайсинга nad5b/nad5c , выделены синим цветом.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0052644.s002
(PDF)
Файл S3.
Экспрессия трансгенов nad1e после электропорации изолированных митохондрий пшеницы. (A) Были использованы четыре конструкции: ( Mat1 ) содержит весь 3′-половину интрона 4 ( 3′ nad1-I4 ) и экзон nad1e, связанный с инвертированным повтором из некодирующей области апоцитохрома пшеницы ген b ( cob ); ( Dx1 ) содержит только домен матуразы ( Dx ) из ORF mat-r , который был связан с областью Ir-cob .Те же самые последовательности были слиты с промотором субъединицы 2 цитохромоксидазы ( cox2 ) для получения рекомбинантных векторов coxMat1 и cox2Dx1 . (B) Электрофорез в агарозном геле продуктов ПЦР, полученных после трех вложенных реакций ПЦР по 20 циклов каждая, с использованием праймеров cob3′(1)AS, cob3′(2)AS или cob3′(3)AS в сочетании с праймерами Dx1S, Dx2S или Дх3С. Показана одна из четырех контрольных реакций ПЦР, проведенных на образцах, в которых обратная транскриптаза не использовалась в реакциях кДНК (-RT).Маркер размера ДНК BenchTop 1kb DNA Ladder (Promega). Используемые праймеры указаны в файле S1.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0052644.s003
(PDF)
Файл S4.
Электрофореграмма клонированного nad1 транс — сплайсированного продукта ПЦР, полученного после электропорации nad1e химерного гена. (A) Соединения между экзонами nad1b и nad1c , полный экзон d, соединения с nad1c и слияние между экзонами nad1c и nad1c 8(B) Последовательность 3″-конца химерного транскрипта, показывающая связь между концом nad1e и последовательностью терминатора IR-cob .
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0052644.s004
(PDF)
Благодарности
Авторы благодарят Эвелин Лепаж за прекрасную техническую поддержку. Мы также благодарим Amber Hotto за полезные комментарии и предложения. Мы в долгу перед Изабель Девор за ценную помощь на протяжении всего исследования.
Вклад авторов
Идея и разработка экспериментов: JCF BC AA.Выполнены опыты: JCF BC CA AA. Проанализированы данные: JCF BC CA AA. Написал статью: AA JCF BC.
Каталожные номера
- 1. Liere K, Weihe A, Borner T (2011) Механизмы транскрипции митохондрий и хлоропластов растений: состав, функции и регулирование. J Plant Physiol 168: 1345–1360.
- 2. Kuhn K, Weihe A, Borner T (2005) Множественные промоторы являются общей чертой митохондриальных генов у арабидопсиса. Nucleic Acids Res 33: 337–346.
- 3. Бонен Л. (2008)Цис- и транс-сплайсинг интронов группы II в митохондриях растений. Митохондрия 8: 26–34.
- 4. Castandet B, Araya A (2011) Редактирование РНК в растительных органеллах. Зачем упрощать? Биохимия (Москва) 76: 924–931.
- 5. Блан В., Литвак С., Арая А. (1995) Редактирование РНК в митохондриях пшеницы происходит по механизму дезаминирования. FEBS Lett 373: 56–60.
- 6. Бегу Д., Грейвс П.В., Домек С., Арселин Г., Литвак С. и др.(1990) Редактирование РНК субъединицы 9 митохондриальной АТФ-синтазы пшеницы: прямое секвенирование белка и кДНК. Растительная ячейка 2: 1283–1290.
- 7. Ковелло П.С., Грей М.В. (1990) Последовательность РНК и природа сайта связывания CuA в цитохром-с-оксидазе. Письмо ФЭБС 268: 5–7.
- 8. Hernould M, Suharsono S, Litvak S, Araya A, Mouras A (1993)Индукция мужской стерильности в трансгенных растениях табака с неотредактированным митохондриальным геном atp9 из пшеницы. Proc Natl Acad Sci U S A 90: 2370–2374.
- 9. Zabaleta E, Mouras A, Hernould M, Suharsono, Araya A (1996)Трансгенное растение с мужской стерильностью, индуцированное неотредактированным геном atp9, восстанавливает фертильность путем ингибирования его экспрессии с помощью антисмысловой РНК. Proc Natl Acad Sci U S A 93: 11259–11263.
- 10. Sharp PA (1991) «Пять легких пьес». Наука 254: 663.
- 11. Мартин В., Кунин Е.В. (2006) Интроны и происхождение компартментализации ядра и цитозоля. Природа 440: 41–45.
- 12.Мишель Ф., Ферат Дж.Л. (1995)Структура и активность интронов группы II. Annu Rev Biochem 64: 435–461.
- 13. Waldsich C, Pyle AM (2007)Элемент управления складыванием для третичного коллапса рибозима интрона группы II. Nat Struct Mol Biol 14: 37–44.
- 14. Zanlungo S, Quinones V, Moenne A, Holuigue L, Jordana X (1995)Сплайсинг и редактирование транскриптов rps10 в митохондриях картофеля. Курр Жене 27: 565–571.
- 15. Wissinger B, Schuster W, Brennicke A (1991)Транс-сплайсинг в митохондриях Oenothera: мРНК nad1 редактируются в последовательностях экзона и транс-сплайсинга группы II интрона.Ячейка 65: 473–482.
- 16. Биндер С., Марчфельдер А., Бреннике А., Виссинджер Б. (1992) Редактирование РНК при транс-сплайсинге интронных последовательностей мРНК nad2 в митохондриях Oenothera. J Biol Chem 267: 7615–7623.
- 17. Bégu D, Castandet B, Araya A (2011) Редактирование РНК восстанавливает критические домены интрона группы I в митохондриях папоротника. Курр Жене 57: 317–325.
- 18. Börner GV, Morl M, Wissinger B, Brennicke A, Schmelzer C (1995) Редактирование РНК интрона группы II у Oenothera как необходимое условие для сплайсинга.Мол Ген Генет 246: 739–744.
- 19. Carrillo C, Bonen L (1997)Статус редактирования РНК интронных доменов nad7 в митохондриях пшеницы. Нуклеиновые кислоты, рез. 25: 403–409.
- 20. Castandet B, Choury D, Bégu D, Jordana X, Araya A (2010) Редактирование интронной РНК необходимо для сплайсинга в митохондриях растений. Нуклеиновые кислоты Рез. 38: 7112–7121.
- 21. Chapdelaine Y, Bonen L (1991)Митохондриальный ген пшеницы для субъединицы I комплекса НАДН-дегидрогеназы: модель транс-сплайсинга для этого гена по частям.Ячейка 65: 465–472.
- 22. Pereira de Souza A, Jubier MF, Delcher E, Lancelin D, Lejeune B (1991) Модель транс-сплайсинга для экспрессии трехчастного гена nad5 в митохондриях пшеницы и кукурузы. Заводская ячейка 3: 1363–1378.
- 23. Бегу Д., Меркадо А., Фарре Дж. К., Моенн А., Олуиг Л. и др. (1998) Статус редактирования транскриптов mat-r в митохондриях двух видов растений: изменения C-to-U происходят в предполагаемых функциональных доменах RT и матуразы. Курр Жене 33: 420–428.
- 24. Farré JC, Araya A (1999) Открытая рамка считывания mat-r транскрибируется с неканонического промотора и содержит внутренний промотор для совместной транскрипции экзонов nad1e и nad5III в митохондриях пшеницы. Завод Мол Биол 40: 959–967.
- 25. Li CF, Costa M, Michel F (2011)Связывание спирали точки ветвления с недавно обнаруженным рецептором позволяет формировать лариат с помощью интрона группы II. EMBO J 30: 3040–3051.
- 26. Schmelzer C, Schweyen RJ (1986) Самостоятельный сплайсинг интронов группы II in vitro: картирование точки ветвления и мутационное ингибирование образования лариата.Ячейка 46: 557–565.
- 27. Schlatterer JC, Crayton SH, Greenbaum NL (2006) Конформация сайта разветвления интрона группы II в растворе. J Am Chem Soc 128: 3866–3867.
- 28. де Лонгевиаль А.Ф., Мейер Э.Х., Андрес С., Тейлор Н.Л., Лурин С. и соавт. (2007) Ген пентатрикопептидного повтора OTP43 необходим для транс-сплайсинга митохондриального интрона 1 nad1 у Arabidopsis thaliana. Растительная ячейка 19: 3256–3265.
- 29. Schmitz-Linneweber C, Williams-Carrier RE, Williams-Voelker PM, Kroeger TS, Vichas A, et al.(2006) Белок пентатрикопептидных повторов облегчает транс-сплайсинг пре-мРНК rps12 хлоропластов кукурузы. Растительная клетка 18: 2650–2663.
- 30. de Longevialle AF, Small ID, Lurin C (2010) Кодируемые ядром факторы сплайсинга, участвующие в сплайсинге РНК в органеллах высших растений. Мол завод 3: 691–705.
- 31. Фарре Дж. К., Чоури Д., Арая А. (2007) В исследованиях экспрессии генов органеллы и редактирования РНК путем опосредованной электропорацией трансформации изолированных митохондрий растений.Методы Enzymol 424: 483–500.
- 32. Carrillo C, Chapdelaine Y, Bonen L (2001)Вариации последовательности и редактирования РНК в основных доменах митохондриальных интронов группы II среди растений. Мол Ген Генет 264: 595–603.
- 33. Li-Pook-Than J, Bonen L (2006) Множественные физические формы вырезанных интронных РНК группы II в митохондриях пшеницы. Нуклеиновые кислоты Рез. 34: 2782–2790.
- 34. Фогель Дж., Борнер Т. (2002)Формирование лариата и гидролитический путь в сплайсинге интронов группы II хлоропластов растений.EMBO J 21: 3794–3803.
- 35. Пайл А.М. (2010)Третичная структура интронов группы II: значение для биологической функции и эволюции. Crit Rev Biochem Mol Biol 45: 215–232.
- 36. Choury D, Farre JC, Jordana X, Araya A (2005)Исследования экспрессии генов в изолированных митохондриях: Solanum tuberosum rps10 распознается родственным картофелем, но не механизмом транскрипции, сплайсинга и редактирования митохондрий пшеницы. Нуклеиновые кислоты Рез. 33: 7058–7065.
- 37. Farré JC, Araya A (2001)Экспрессия генов в изолированных митохондриях растений: высокая точность транскрипции, сплайсинга и редактирования трансгенного продукта в электропорированных органеллах. Нуклеиновые кислоты Рез. 29: 2484–2491.
- 38. Элина Х, Браун Г.Г. (2010)Обширный неправильный сплайсинг двухкомпонентного интрона митохондриальной группы II растений. Нуклеиновые кислоты, рез. 38: 996–1008.
- 39. Farré JC, Araya A (2002)Сплайсинг РНК в митохондриях высших растений: определение функциональных элементов в интроне группы II из химерного гена cox II в электропорированных митохондриях пшеницы.Завод J 29: 203–213.
- 40. van der Veen R, Kwakman JH, Grivell LA (1987) Мутации в акцепторном сайте лариата делают возможным самосплайсинг интрона группы II без образования лариата. EMBO J 6: 3827–3831.
- 41. Daniels DL, Michels WJ Jr, Pyle AM (1996) Два конкурирующих пути самосплайсинга интронами группы II: количественный анализ скорости и продуктов реакции in vitro. Дж. Мол. Биол. 256: 31–49.
- 42. Chu VT, Liu Q, Podar M, Perlman PS, Pyle AM (1998)Более одного способа сплайсинга РНК: ветвление без выпуклости и сплайсинг без ветвления в интронах группы II.РНК 4: 1186–1202.
- 43. Jarrell KA, Dietrich RC, Perlman PS (1988) Домен 5 интрона группы II облегчает реакцию транс-сплайсинга. Мол Селл Биол 8: 2361–2366.
- 44. Chanfreau G, Jacquier A (1996) Конформационное изменение РНК между двумя химическими стадиями самосплайсинга группы II. EMBO J 15: 3466–3476.
- 45. Коста М., Деме Э., Жакье А., Мишель Ф. (1997) Множественные третичные взаимодействия с участием домена II саморасщепляющихся интронов группы II.Дж. Мол. Биол. 267: 520–536.
- 46. Hamill S, Pyle AM (2006) Рецептор для стыковки сайта разветвления с активным сайтом интрона группы II. Мол Ячейка 23: 831–840.
- 47. Li CF, Costa M, Bassi G, Lai YK, Michel F (2011)Рекуррентная вставка 5′-концевых нуклеотидов и потеря мотива точки ветвления в линиях интронов группы II, встроенных в митохондриальные прерибосомные РНК. РНК 17: 1321–1335.
- 48. Granlund M, Michel F, Norgren M (2001)Взаимоисключающее распространение IS1548 и GBSi1, активного интрона группы II, идентифицированного в человеческом изоляте стрептококков группы B.Дж. Бактериол 183: 2560–2569.
- 49. Тур Н., Робарт А.Р., Кристиансон Дж., Зиммерли С. (2006)Самосплайсинг интрона группы IIC: 5′-экзонное распознавание и события альтернативного 5′-сплайсинга связаны с мотивом «стебель-петля» терминатора транскрипции. Нуклеиновые кислоты Рез. 34: 6461–6471.
- 50. Осенберг С., Паз Яаков Н., Сафран М., Мошковиц С., Штрихман Р. и др. (2010) Последовательности Alu в недифференцированных эмбриональных стволовых клетках человека демонстрируют высокий уровень редактирования РНК A-to-I.PLoS One 5: e11173.
- 51. Леванон Э.Ю., Айзенберг Э., Елин Р., Немзер С., Халлеггер М. и соавт. (2004) Систематическая идентификация обильных сайтов редактирования A-to-I в транскриптоме человека. Nat Biotechnol 22: 1001–1005.
- 52. Laurencikiene J, Kallman AM, Fong N, Bentley DL, Ohman M (2006)Редактирование РНК и альтернативный сплайсинг: важность ко-транскрипционной координации. EMBO Rep 7: 303–307.
- 53. Finta C, Zaphiropoulos PG (2002)Межгенные молекулы мРНК, полученные в результате транс-сплайсинга.J Biol Chem 277: 5882–5890.
Силиконовые чувствительные к давлению клеи для сращивания лент
Производители широкорулонных этикеток и лент должны работать бесперебойно и эффективно с минимальными перерывами и остановками, чтобы сделать свой процесс экономичным и рентабельным. Автоматические револьверные головки позволяют начинать новый валок, когда предыдущий валок останавливается, поскольку в них используется летучее соединение: процесс, позволяющий задней кромке предыдущего валка соприкасаться с передней кромкой нового валка и протягивать ее в обработать.Когда рулоны представляют собой рулоны с силиконовым покрытием, силиконовый клей, чувствительный к давлению, создает идеальную липкую ленту для склеивания задней и передней кромки бумаги, чтобы они склеивались по пути движения полотна и в печь, и все это в одном гладком непрерывном процессе.
Сращивание подложек с низкой поверхностной энергией или силиконовых съемных пленок может быть сложной задачей, вам необходимо найти идеальный клей, чувствительный к давлению, который эффективно и надежно соединит ваши рулоны вместе или устранит возможные разрывы полотна во время конвертирования.Силиконовые клеи, чувствительные к давлению, обеспечат вам эти и другие характеристики, поскольку они прилипают к различным поверхностям и устойчивы к широкому диапазону температур.
Каковы ключевые факторы для силиконовых клеев, чувствительных к давлению, для сращивания лент?
Силиконовые клеи, чувствительные к давлению (PSA)Silcolease™ обладают всеми ключевыми свойствами, которые ищут инженеры по ленточным лентам:
- Быстрое приклеивание к силиконовым поверхностям, пленкам, бумаге и различным материалам за считанные секунды.Silcolease™ PSA предлагает широкий диапазон значений липкости: низкий, средний и высокий уровни липкости
- Хорошая чистота, позволяющая выдерживать удары от летящего стыка, движения через головки для нанесения покрытий и высокого натяжения бумаги или пленки в процессе нанесения покрытия на полотно
- Высокая термостойкость, чтобы выдерживать температуры в духовке до 250 o C
Зачем сотрудничать с Elkem Silicones для производства силиконовых клеев, чувствительных к давлению?
- Наши технические эксперты со всего мира помогут вам выбрать правильную систему для вашего приложения.
- Мы предлагаем обучение, устранение неполадок и техническую помощь, когда вам это нужно больше всего.
- Наши знания и опыт помогут вам быстрее вывести свою продукцию на рынок.
- Мы работаем с вами, чтобы предоставить силиконовые решения с индивидуальным подходом.
Elkem Silicones Product Technologies
Silcolease™ Силиконовые клеи, чувствительные к давлению , доступны по технологии пероксидного отверждения PSA.
специалиста PSA вам в помощь!
Чтобы узнать больше о том, как выбрать клей, чувствительный к давлению, который лучше всего соответствует вашим требованиям, свяжитесь с нашей командой технической службы , чтобы получить индивидуальный подход при выборе того, что лучше всего подходит для вашего приложения.
Услуги по сварке Fusion
Описание:
Adtell Integration способен удовлетворить ваши требования к сварке плавлением, независимо от того, требуется ли им одномодовое, многомодовое или ленточное сращивание.
Услуги по сварке Fusion:
- Полное сращивание оптоволокна (сращивание одиночного волокна и/или ленты)
- Соединение для телекоммуникаций и кабельного телевидения
- Аварийное восстановление и «горячая резка» в процессе эксплуатации
- Установка центра обработки данных
- Помещение (Офис) Многомодовый
- Сращивание и крепление антенных волокон
- Сращивание волокон под землей
Услуги подрядчика/заказчика по сращиванию и установке Fusion:
Adtell Integration предлагает услуги по сварке сваркой по всей стране.Мы используем оборудование для сварки Fujikura FSM-60S, рефлектометры EXFO и измерительные приборы, чтобы предоставить вам полные документированные результаты. Эта программа предназначена для клиентов, которые прокладывают собственное волокно или пользуются услугами местных подрядчиков по электроснабжению. Мы также предоставляем центры распределения оптоволокна для полных системных решений. Услуги по сращиванию Fusion также доступны для кабельного телевидения и телефонной связи.
-
- Оплата труда – в цену входит оплата труда по оказанию услуг, включая тестирование и документацию.Эта цена является фиксированной стоимостью единицы.
4 соединения или меньше на точку + мобилизация
• Инженерные услуги – Подготов. Цена 275,00 долларов США за точку
• Инженерные услуги — за соединение Цена 67,00 долларов США за соединение от 5 до 8 соединений или меньше на точку + мобилизация
• Инженерные услуги — подготовка. Цена 225,00 долларов США за точку
• Инженерные услуги — за соединение Цена 47,00 долларов США за соединение9 или более соединений + мобилизация
• Инженерные услуги — подготовка. Цена 225,00 долларов США за точку
• Инженерные услуги — Цена за соединение 27 долларов США.00 на соединение - Поездки/мобилизация. Командировки/мобилизация не оплачиваются, если трудозатраты на каждую поездку/этап превышают минимальную трудозатратность, как указано ниже. Если указанный минимум трудозатрат не будет выполнен, то мобилизационные расходы будут включены в стоимость проекта. Минимальный трудовой сбор (6000 долларов США) или мобилизационный сбор (1750 долларов США)
- Расходы – ежедневные суточные включены в вышеуказанную цену.
- Оборудование – сварочный аппарат, рефлектометр, набор для проверки затухания и стоимость использования комплекта инструментов включены в стоимость труда.
- Гарантия — на все оборудование и услуги, поставляемые Adtell Integration, предоставляется двухлетняя (2) гарантия.
- Оплата труда – в цену входит оплата труда по оказанию услуг, включая тестирование и документацию.Эта цена является фиксированной стоимостью единицы.
* Указанная выше цена НЕ включает оборудование.
* Вышеуказанные цены были разработаны с учетом того, что указанный объем работ соблюдается.
Независимая сертификация. Adtell Integration сертифицирует вашу установку. Мы предоставим вам показания рефлектометра и счетчиков для вашего существующего оптоволоконного завода.
Процедуры интеграции и установки Adtell:
- Интеграция Adtell предоставляет предварительно загруженные клеммные коробки.У заказчика есть монтажная коробка отдела технического обслуживания/местного электрика
- Adtell Integration предлагает оптоволоконный кабель и внутренний канал. Заказчик поручил отделу технического обслуживания/местному электрику вытащить кабель и оставить его не подключенным
- Adtell Integration Fusion сращивает волоконно-оптический кабель, тестирует и сертифицирует установку
- Дополнительные услуги (указаны отдельно): проверка видео с изображениями JPEG, двунаправленное тестирование, ORL (измерение оптических обратных потерь)
модификаций m6A мРНК откладываются в зарождающейся пре-мРНК и не требуются для сплайсинга, но определяют цитоплазматический оборот
- Шэндун Кэ1,2,
- Эми Пандья-Джонс3,
- Юки Сайто1,2,
- Джон Дж.Фак1,2,
- Катрин Броберг Вогбё4,
- Шай Геула5,
- Джейкоб Х. Ханна5,
- Дуглас Л. Блэк3,
- Джеймс Э. Дарнелл младший 6 и
- Роберт Б. Дарнелл1,2
- 1 Лаборатория молекулярной нейроонкологии Рокфеллеровского университета, Нью-Йорк, Нью-Йорк 10065, США;
- 2 Медицинский институт Говарда Хьюза, Университет Рокфеллера, Нью-Йорк, Нью-Йорк 10065, США;
- 3 Кафедра микробиологии, иммунологии и молекулярной генетики Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе, Лос-Анджелес, Калифорния , США;
- 4 Основной центр протеомики и метаболомики, Департамент исследований рака и молекулярной медицины, Норвежский научный университет и технологии, 7489 Тронхейм, Норвегия;
- 5 Отделение молекулярной генетики, Научный институт Вейцмана, Реховот 7610001, Израиль;
- 6 Лаборатория молекулярной клеточной биологии Рокфеллеровского университета, Нью-Йорк, Нью-Йорк 10065, США
- Авторы, переписывающиеся: darnelr{at}rockefeller.образование, Дарнелл{в}rockefeller.edu
Аннотация
Понимание биологической роли N 6 -метиладенозина (m 6 A) РНК-модификаций в мРНК требует понимания того, когда и где в жизни транскрипта пре-мРНК эти модификации сделаны. Мы обнаружили, что зарождающаяся пре-мРНК (CA-РНК), связанная с хроматином клеток HeLa, содержит много несплайсированных интронов и m 6 A в экзонах, но очень редко в интронах.Метилирование m 6 A практически завершается при высвобождении мРНК в нуклеоплазму. Кроме того, содержание и место каждого м 6 Модификация стационарной цитоплазматической мРНК практически неотличима от таковой во вновь синтезированной CA-РНК или нуклеоплазматическая мРНК. Этот результат свидетельствует о том, что в цитоплазматической мРНК происходит количественно незначительное метилирование или деметилирование. Кроме того, только ~10% m 6 As в CA-РНК находятся в пределах 50 нуклеотидов от 5′- или 3′-сайтов сплайсинга, а подавляющее большинство экзонов, несущих m 6 A в стволовых клетках мыши дикого типа, сплайсировали то же самое в клетках, лишенных основной m 6 A метилтрансферазы Mettl3.И HeLa, и мРНК эмбриональных стволовых клеток мыши, содержащие m 6 As, имеют более короткий период полураспада, и тысячи этих мРНК имеют увеличенный период полураспада (в два раза или более) в нокаутных клетках Mettl3. по сравнению с диким типом. Таким образом, m 6 A добавляется к экзонам до или вскоре после определения экзона в зарождающейся пре-мРНК, и хотя m 6 A не требуется для большинства сплайсингов, его добавление в зарождающийся транскрипт является детерминантой цитоплазматической мРНК. стабильность.
-
Навигация по записям