Диагностика лада гранта своими руками: Как сделать диагностику двигателя лада гранта

Содержание

Как сделать диагностику двигателя лада гранта


Диагностика и расшифровка кодов на Ладе Гранта

Одним из отличий автомобиля Лада Гранта от других отечественных моделей транспортных средств является бортовой компьютер, которым оснащены эти авто. Он позволяет не только оптимизировать процесс работы двигателя, но и выявлять коды ошибок Lada Granta. Именно с его помощью можно оперативно выявить появившиеся неисправности в работе бк.

Но как же произвести диагностику бортового компьютера «Штат Х1» Лада Гранта на предмет ошибок? И как после этого расшифровать коды? Подробнее об этих и других вопросах вы можете узнать в этой статье.

Как можно использовать диагностическую колодку

1 . Напрямую по назначению. Для диагностики автомобиля при помощи адаптера, который подключен к компьютеру или телефону, или к специальному диагностическому прибору.

2 . С целью побаловаться. Подключите адаптер и установите на телефон программу Torque, соединитесь с ней при помощи bluetooth-подключения, и можете смотреть данные в режиме он-лайн. А если у Вас телефон с GPS, то вы можете измерить разгон до 100 км/ч, время прохождения участка и прочее.

3 . Просмотр температуры двигателя. Так как в первых версиях автомобиля не было индикации температуры двигателя на панели приборов, то многие владельцы использовали диагностический разъём для подключения бортовых компьютеров, которые показывают многие параметры, в том числе и температуру двигателя. А так как большинство владельцев Гранты жалуются на низкую рабочую температуру двигателя, то бортовые компьютеры являются очень популярным решением данной проблемы.

Новая Лада: Устройство электронной системы управления двигателем в автомобилях семейства Лада-Самара, Лада-Калина, Лада-Гранта с контролером М74 ЕВРО-4)

Самостоятельное диагностирование позволяет не только отыскать ошибки, присутствующие в памяти блока, но и сэкономить владельцу финансовые средства. Для реализации процесса можно применить обычный ноутбук, в памяти которого уже присутствует заранее приобретенная сканирующая программа. В течение 1-2 минут этот софт проверит систему автомобиля и выдаст результаты по всем параметрам мотора и прочих узлов, и обозначит где находится неисправность.

Диагностика

Чтобы расшифровать появившиеся коды ошибок, необходимо осуществить диагностику транспортного средства. Проверка машины может осуществляться несколькими способами. О них мы поговорим далее.


Автомобиль Лада Гранта седан

Диагностика со сканером

Чтобы произвести проверку при помощи сканера, необходимо бортовой компьютер «Штат Х1» подключить к тестеру или ноутбуку посредством диагностического кабеля. Сканер или ноутбук должен быть оснащен программным обеспечением, предназначенным специально для диагностики. В нашей статье мы рассмотрим пример с программой KWP_D.

Помимо этой утилиты вам также нужно будет найти специализированный OBD-II адаптер. Он необходим для того, чтобы передавать информацию с бк на ноутбук через USB-выход. Разъем для диагностики находится рядом с селектором коробки передач, под крышкой. К нему и нужно подключить сканер.

Когда программа будет установлена, при подключении вы увидите, что в системе появился СОМ-выход с определенным номером. Этот номер необходимо будет переназначить на любой из четырех — 1-4. Когда это сделано, ноутбук нужно подключить к бк, затем запустить зажигание и включить ПО.

Как известно, любой мотор авто имеет свои характеристики, которые определяют его работу. Если эти характеристики отличаются от стандартных, то это значит, что с работой двигателя что-то не то. Первый момент, на который нужно обратить внимание — это характеристика DTC. Если в системе бк обнаружены неисправности, то откройте вкладку «Кода ошибок» и найдите номер вместе с расшифровкой. Обратите внимание: с вашей Ладой Грантой будет все в норме, если измеренные характеристики не отличаются от стандартных больше, чем на 20%.

Диагностика без сканера

Проверка машины без сканера — совсем нетрудное занятие. Недостатком такой диагностики является то, что она не всегда позволяет выявить все ошибки в работе авто. :

Инструкция по диагностике Лады Гранта через OBD2 разъем своими руками через ноутбук или смартфон

Определить, где находится OBD2 разъем

Определить какой автосканер подойдет для автомобиля

Подбор сканера (адаптера) для LADA GRANTA зависит от модели ЭБУ, а так же нужд диагноста / автовладельца.

Для подбора диагностического оборудования воспользуйтесь калькулятором: «Подбор сканера для Лады Гранта»

Для диагностического адаптера необходим софт, который устанавливается на ноутбук или смартфон/планшет. Для автосканеров со своей програмной оболочкой и дисплеем софт не потребуется.

Для подбора программы для адаптера перейдите в раздел: «Программы»

Воспользоваться инструкцией и провести диагностику

При покупке адаптера инструкции поставляются в комплекте. Более подробные инструкции по диагностическим автосканерам и описание их работы размещены в разделе: «Обзоры OBD2 автосканеров»

Определить ошибки и расшифровать их

Коды ошибок и их расшифровка выводятся в интерфейсе программы сканера. Так же можно изучить полную базу ошибок для вашего автомобиля в разделе: «OBD2 коды ошибок Лада Гранта»

Сделать ремонт согласно расшифровке ошибки

Производится ремонт узла согласно расшифровке ошибки (проблемы) или обратиться в автосервис для устранения той или иной неисправности.

Проверить ошибки повторно

Scan Tool Pro — бюджетный мультисканер для LADA GRANTA

Хороший выбор для начинающего диагноста

Сейчас в продаже имеются модели сканеров с различными версиями прошивок и чипов. Scan Tool Pro с прошивкой 2021 — пока что самая стабильная версия, а так же имеет максимальную совместимость с автомобилями с 2001 года выпуска в том числе с LADA и ВАЗ.

По ссылке указанной справа можно ознакомиться со сканером для автодиагностики «Scan Tool Pro». Это сайт официального дилера, который дает гарантию 12 месяцев.

Расшифровка комбинаций

Что же, теперь пришло время рассказать вам о расшифровке комбинаций неисправностей.


Диагностический разъем для подключения к бортовому компьютеру

Расшифровка кодов после диагностики со сканером

Как сказано выше, если измеренные характеристики не отличаются от стандартных больше, чем на 20%, то с авто все в порядке. Каковы же стандартные параметры?

ПараметрЗначение
UACCПоказывает напряжение АКБ. Чтобы понять, есть ли ошибка в этом случае, необходимо активировать все устройства, наиболее потребляющие напряжение. Допустимое напряжение — от 13.9 до 14.5В. Если оно меньше — то необходимо проверять отдельные цепи сети.
THRПараметр положения дроссельной заслонки. Как правило, если он неисправен, то водитель узнает об этом и без диагностики, так как авто будет идти рывками, а мощность двигателя будет постоянно падать. Нажмите на педаль газа, при этом не запуская двигатель, но включив зажигание. Показания ДПДЗ должны плавно вырасти до 90% (или чуть меньше). Если все так, то датчик исправен, если нет — его нужно заменить.
FREQПараметр частоты вращения коленчатого шкива. Частота вращения составляет до 840 оборотов. Если этот датчик выходит из строя, то работа мотора будет невозможной.
AIRПараметр массового расхода воздуха. Он не должен превышать 12 кг/час. Запустите мотор и зажмите педаль газа, чтобы количество оборотов выросло до 5 тысяч в минуту. В этом случае параметр должен увеличиться примерно до 250 кг/час. Естественно, если устройство исправное, то показатель будет таким.
UOZПредставляет собой угол опережения зажигания. Он должен изменять в диапазоне от 6 до 15 градусов.
INJЭтот параметр бк представляет собой длительность импульса впрыска (время, которое необходимо для открытия каждой форсунки, чтобы бензин попал в цилиндр). В идеале этот параметр должен составляет от 3 до 5 миллисекунд при движении на нейтральной скорости. В том случае, если полученные в ходе диагностики показания гораздо выше, то, по всей видимости, форсунки уже забиты и их необходимо прочистить. Или же это свидетельствует о слабом давлении бензина в результате засоренного бензинового фильтра или насоса. Зажмите резко педаль газа. Время впрыска должно увеличиться до 20 мс. В идеале точная диагностика форсунок возможна только при помощи стенда.
FSMПоказатель работы датчика холостого хода. В идеале этот параметр не должен превышать 50-60. Если вы резко нажимаете на педаль газа, то он может увеличиться до 160-180.
ALAM 1Показывает уровень напряжения, который зафиксирован на устройстве контроля уровня кислорода. Когда мотор машины прогрет, этот показатель должен увеличиться от 0.007 до 0.7 В. Если данный показатель различается, то с цепью что-то не в порядке.
LUMS_WЭтот коэффициент говорит о вращении коленчатого шкива. В идеале он должен варьироваться в районе 4 оборотов в секунде. Если он чуть больше, то это уже свидетельствует о пропуске зажигания в цилиндрах мотора. Это значит, что следует уделить внимание проверку свечей зажигания (исправны ли они, залиты или нет), а также состоянию высоковольтных проводов.
QTКоэффициент расхода бензина. При включенном двигателе на холостом ходу он не должен превышать 0.9 литров в час.

Рекомендованные сообщения

ShDim

Недавно приобрел Скандок, посмотрел а в вкладке VAZ, Гранту не обноружил. Подскажите пожалуйста, как скандоком Вы подключались?

Лучшие авторы в этой теме

bertjashov

В опциях поставьте галку “Бета-тестирование” и выбор Гранты появится (Андрей сказал что пока не совсеми блоками работает)я пробывал только на одной взял нормально.Но разъем искал долго… :muhahaha:

Не будет не платных, не бесплатных железо слабовато у хрюнов(аппаратная часть)

Планируют новый адаптер выпустить с поддержкой J2534 он будет как для диагностики так и для лодыря. Скорее всего только новый и будут развивать!

Изменено 11 апреля 2012 пользователем bertjashov

sergei726

мужчины! кто нибудь накопал прогу для данной коляски на ELM 327? СКАНМАСТЕР смотрит Гранту но убого через “жопу@? впрочем как и все авто ВАЗ.

Андрей

мужчины! кто нибудь накопал прогу для данной коляски на ELM 327? СКАНМАСТЕР смотрит Гранту но убого через “жопу@? впрочем как и все авто ВАЗ.

ну или прогу под опен порт 2.0? у кого есть какие наработки, поделитесь!

машин таких пока не заезжало, но надо быть готовым, а сканмат второй пока не брал!

abrakadabra

А авто асс корректно ее щупает?

yuram80

Изменено 8 июля 2012 пользователем yuram80

alexur

Это м75 вероятно. Тоже по обд приходится щучить.В следующий раз Бошем попробую,вроде недавно немчура обновила.

andruxaershov

Это м75 вероятно.Тоже по обд приходится щучить.В следующий раз Бошем попробую,вроде недавно немчура обновила.

а М75 как 17.9.7?Там же нет КАН шины нет да и на гранты их не ставят-это же аналог МЕ17 для 16 вэлв,тока проц сооовсем другой

Минатула

А авто асс корректно ее щупает?

Диагност-непрофи

Вроде как по протоколу МЕ 17.9.7 можно связаться https://www.oktja.ru/…d1%83-%d0%bc75/

Минатула

может и так но у меня ни через опендиаг ни через автоасс связь не пошла

GASCHE

alexur

а М75 как 17.9.7?Там же нет КАН шины нет да и на гранты их не ставят-это же аналог МЕ17 для 16 вэлв,тока проц сооовсем другой

vmaster777

Автоасс нормально у меня берет ме17.9.7. Просто бывает он сам определяет ЭБУ а бывает приходится в ручном режиме блок выбирать приходится.

andruxaershov

Трейдом смотрел уже,вроде как параметры адекватные…. (хотел у него блок подменить на 17.9.7,а этот себе оставить…..разнылся клиент блин)

Изменено 9 июля 2012 пользователем andruxaershov

Минатула

Автоасс нормально у меня берет ме17.9.7. Просто бывает он сам определяет ЭБУ а бывает приходится в ручном режиме блок выбирать приходится.

вобще то если прочесть внимательнее то я не писал что автоасс не берет ме17 9 7

Изменено 9 июля 2012 пользователем Минатула

alexur

Трейдом смотрел уже,вроде как параметры адекватные….(хотел у него блок подменить на 17.9.7,а этот себе оставить…..разнылся клиент блин)

Это уже хорошо.Значит забодаем.

IGOR FIB

можно ли сделать диогностику гранты на домашнем компе.

sergei726

можно! занести Ладу Гранту домой, поставить рядом с домашним компом и начать “танцы с бубном”! а если серьёзно: обратитесь к нормальному диагносту!

paul046

можно ли сделать диогностику гранты на домашнем компе.

На домашнем это значит на своём, можно, но надо дорости до уровня этих дядей которые в этой теме спрашивают как и чем диагностить Гранту, прикупить нужный адаптер, прикупить нужную программу, тогда у вас и получится (посмотрите сколько сообщений имеют эти “дяди”, это их опыт).

Олег М

На домашнем это значит на своём, можно, но надо дорости до уровня этих дядей которые в этой теме спрашивают как и чем диагностить Гранту, прикупить нужный адаптер, прикупить нужную программу, тогда у вас и получится (посмотрите сколько сообщений имеют эти “дяди”, это их опыт).

Блок управления двигателем Лады Гранты

Как говорилось в начале статьи, Гранта получила новые «мозги» с поддержкой CAN (M74CAN). Данное нововведение способно интегрировать «мозги» с сигнализациями, магнитолами, имеющими CAN-шину.

Часто ставят контроллер «Стандарт» с номером Ителма 11186-1411020-22: Данный ECU не имеется совместимости с более ранними моделями ВАЗ . В ранних ВАЗах, например, Приора, ЭБУ шёл с К-каналом для передачи данных.

Расположение ЭБУ у Гранты:

«Мозги» располагаются в нижней части передней панели, а точнее под бардачком. Лучше будет видно, если смотреть с пассажирского сиденья. ЭБУ скрыт шумоизолячией и обивкой, поэтому достать его будет не просто.

Прошивки ЭБУ:

У серийных прошивок стоит обозначить на оптимизированную динамичную версию для 1,6-литровой 8-клапанной Гранты с контроллером «М74» и норме уровня выброса отработанных газов «ЕURO-2».

Чип-тюнинг ECU позволяет физически отключить второй датчик кислорода («лямбд зонда») вместе с катализатором. Если реализовать данную версию прошивки, то это приведёт к значительному росту динамических возможностей Гранты.

Чтобы узнать, какая прошивка у блока управления используют приложение OpenDiag, совместно с диагностическим адаптером подключаемому к OBD2 разъему.

Способы диагностики ЭБУ и ошибок на Лада Гранта через OBD2

Самодиагностика

На Гранте в ECM с контроллером М74 встроена самодиагностика, которая определяет неисправности. ECM выявляет проблему, далее загорается «Check Engine» и начинается идентификация ошибки. Далее затем код сохранятся в памяти, и показывается на приборную панель.

Загорелся Check Engine на Гранте?

Подробная статья по причинам Check Engine и как погасить Чек. Если у Вас загорелся Check Engine, срочно прочитайте эту статью. В материале рассказано, что такое Чек Энджин, что делать если он появляется, и как убрать эту ошибку самостоятельно.

Горит лампочка Чек Энджин?

ТОП-15 причин почему загорается лампочка Чек Энджин и пути решения проблемы. Прочитай статью, чтобы решить проблему Check Engine.

Обзоры диагностических сканеров для LADA GRANTA

Читай подробные статьи по обзору автосканеров, в том числе совместимых и с LADA GRANTA.

Обзоры OBD2 диагностических автосканеров

В разделе представлены описания диагностических сканеров и адаптеров. Перед покупкой сканера для своего авто рекомендуется ознакомиться с обзорами на самые популярные модели оборудования.

Тормозная система

Справочно-информационное пособие по ремонту и техническому обслуживанию автомобиля Лада Гранта / ВАЗ 2190

Наш раздел сайта – это справочно-информационное пособие автомобиля LADA Granta / ВАЗ 2190, полное руководство по эксплуатации и техническому обслуживанию, а так же устройство LADA Granta / ВАЗ 2190, укомплектованной бензиновыми двигателями 1,6 л 16V (98 л. с.), 1,6 л 8V (87 л.с.), 1,6 л 8V (80 л.с.).

Представленный раздел нашего сайта создан для того, чтобы помочь владельцам автомобилей LADA Granta / ВАЗ 2190, работникам автосервисов и инженерам СТО поддерживать данный автомобиль в нормальном рабочем состоянии. К тому же наш раздел сайта поможет владельцам автомобилей LADA Granta / ВАЗ 2190 значительно сэкономить денежные средства на ремонт и техническое обслуживание гранты.

Ремонт лада Гранта содержит несколько тысяч цветных изображений с комментариями специалистов и подробным описанием всего пошагового процесса ремонта LADA Granta / ВАЗ 2190. На страницах нашего сайта мы рассматриваем детально ремонт двигателя, предоставляем полные технические характеристики модели в зависимости от комплектации, приводим перечень неисправностей, которые происходят в ходе эксплуатации автомобиля с комментариями опытных специалистов по их устранению. Так же в мельчайших подробностях рассмотрены ремонт и обслуживание системы SRS и кондиционера.

Диагностика Lada цена

Диагностика
Компьютерная диагностика. Современная компьютерная диагностика позволяет, прежде всего, получить полную картину технического состояния Вашего автомобиля. А также сделать оценку того, насколько хорошо взаимодействуют различные узлы друг с другом и, что это может за собой повлечь. Слаженная работа узлов автомобиля зависит от большого числа параметров и взаимодействия устройств и механизмов. Включает в себя диагностику всех электронных систем автомобиля.от 800 руб
Комплексная диагностика автомобиля. Если вы планируете покупать поддержанный автомобиль или долгое время не обследовали своё транспортное средство, мы готовы оказать вам услугу по комплексной проверке узлов и систем вашего автомобиля на предмет работоспособности или оценить приблизительный износ тех или иных деталей. В стоимость включено: – Компьютерная диагностика систем автомобиля – Визуальный осмотр подвески на предмет износа – Визуальный осмотр двигателя и трансмиссии на предмет течи или возможных дефектов – Визуальный осмотр тормозной системы на предмет износа или неисправности – Визуальный осмотр световых и звуковых приборов – Осмотр кузова и состояния лакокрасочного покрытия на предмет целостности или оргинальности элементовот 1600 руб
Диагностика подвески и тормозной системы. В стоимость включено: – Визуальный осмотр подвески и тормозной системыот 800 руб
Диагностика двигателя с замером компрессии. В стоимость включено: – Визуальный осмотр двигателя – Замер компрессииот 1200 руб
Диагностика системы охлаждения. В стоимость включено: – Опрессовка системы охлажденияот 700 руб
Диагностика электрооборудования. В стоимость включено: – Поиск неисправности электрооборудованияот 1000 руб
Диагностика МКПП/АКПП (без снятия). В стоимость включено: – Компьютерная диагностика – Визуальный осмотр МКПП/АКППот 1000 руб

ЛАДА Гранта сбросить ошибку своими руками ? Легко и просто!

Категория: Инструкции   /   2 комментариев

В модели Lada ГРАНТА обеспечивает своему владельцу комфортабельную поездку, но даже тут не стоит беспечно расслабляться и забывать о единой для моделей ВАЗ “глючной” электронной системе, подводящей в неподходящий промежуток времени. Это первоочередно касается индикатора check engine, ДПДЗ, РХХ. Но и ДМРВ не исключает такого поведения. Решительно заявить о устранении всех ошибок мотора и перечисленных датчиков можно только обладая инновационным изобретением с www.diagnost-7.ru- ELM адаптером.

Спасительным кругом адаптер станет не только хозяину ГРАНТА но и моделям Lada других модификаций. Использование собственноручно адаптера решает наболевшую годами проблему самодиагностика любимого “железного коня”, сброса ошибок двигателя , решение проблем перебоев в работе системы электронного самоконтроля Lada ГРАНТА.

Заполучив ELM адаптер (ELM327) вы вступаете в эру самостоятельного контроля систем мониторинга авто, без привлечения извне дорогих специалистов с сомнительными результатами стационарного или мобильного компьютерного исследования.

Адаптер подходит не только для Гранты а еще и для всех других иномарок. Его заказывал здесь www.diagnost-7.ru

 

Ремонт гранты своими руками.

Ремонт лада гранта и рекомендации по эксплуатации и обслуживанию

Этот автомобиль был в числе последних, который сошел с конвейерной линии ВАЗ, сменив любимые многими Ладу Калину и Ладу Самару. Модель сумела достаточно быстро поразить некоторыми достойными признаками. Обновленное авто во многих позициях отличается от производимых до него аналогов, смотрится довольно привлекательно среди модельного ряда отечественной автомобильной промышленности.

Достоинства автомобиля

Счастливчики, владеющие таким автомобилем, считают ее главными преимуществами комфортабельность и вместительность салона, качественную сборку, привлекательное оформление:

Хочется отметить, что и базовая комплектование машины отличается обилием несмотря на то, что цены машины определялись с учетом денежных возможностей средних слоев населения:

Для разработки автомобиля в качестве основы использовали известную всем платформу Калины. Процесс модернизации оставил в прежнем виде лишь двери, целиком изменив кузовную часть. Перемены не обошли и багажное отделение, увеличив его объемность до пятисот литров:

Машина считается по праву надежным транспортным средством, но порой случаются поломки, свойственные данному модельному ряду. По этой причине, решив приобрести такое авто, рекомендуется уточнить, насколько возможен ремонт Лада Гранта своими руками.

Внешний вид машины – важная вещь, о которой заботится любой владелец транспорта. Но от царапин никто не застрахован, и следует знать, как правильно справиться с ними, чтобы не стала образовываться ржавчина.

В общих чертах, схема работ выглядит следующим образом:


Ремонт ходовой

Главное отличие автомобиля – отсутствие опорного ролика на двигателе. Такая особенность становится причиной большого количества неприятных моментов. Предлагаем более наглядно изучить порядок замены маховика при смене задних сальников, выходе из строя зубчатого венца или с целью шлифовки.

Для начала необходимо провести демонтаж коробки передач. Далее, чтобы облегчить себе работы по предстоящей сборке, следует промаркировать размещение маховика и коленвала. Вот теперь разрешается снять маховиковый держатель, но основной элемент при этом должен сохранять неподвижность.

К климатическому оборудованию машины следует подходить аккуратно, кондиционер включать только при работающем двигателе, при запотевании стекол вентилятор активизировать на пониженной скорости.

Не поленитесь пройти диагностику, выполнять регулярное обслуживание машины. Данные меры помогут вам избежать серьезных неприятностей и, как следствие, существенных финансовых затрат.

Новая Лада 2170

Прочно заняла свое место на отечественном авторынке и выходит на передовые позиции по количеству продаж за год. Новинка АвтоВАЗа порадовала любителей комфортных поездок при не слишком больших затратах. Прототип бюджетной иномарки более доступен для российского потребителя, но, возможно, не настолько долговечен.

Продукция отечественного автопрома выгодна тем, что в случае поломки и необходимости заменить деталь ее с легкостью можно найти на любом авторынке.

Если у вас автомобиль Лада Гранта, ремонт своими руками можно провести в собственном гараже, без дополнительных затрат на автосервисы. Главное — наличие подходящих инструментов.

Как это ни печально, но ничто не вечно. И у автомобилей Лада Гранта возникают мелкие неисправности и крупные поломки. Какой же ремонт можно провести своими руками, не прибегая к помощи профессиональных мастеров?

Замена поврежденных деталей авто

Демонтаж маховика проводится в нескольких случаях: замена заднего сальника, поломка зубчатого венца, для шлифовки поверхности маховика под ведомый диск сцепления. Сначала придется снимать коробку передач. Для удобства дальнейшей сборки деталей рекомендуется промаркировать расположение коленвала и маховика.

Болты, скрепляющие маховик, выдвинуть, придерживая устройство, чтобы оно не сместилось. Состояние зубьев оценивается визуально. На поверхности не должно быть никаких заусенцев. Для удобства оценки рекомендуется провести по поверхности пальцем. Неисправный маховик заменяется на новый, деталь устанавливается на место.

Прокладка защищает двигатель от вытекания моторного масла и охлаждающей жидкости, а заменять ее на новую следует не только при повреждении, но и при каждом вмешательстве в блок цилиндров, так как она считается одноразовой.

Замену удобнее всего проводить сразу же после остановки автомобиля, в это время значительно снижено давление. Поршень первого цилиндра устанавливается в позицию ВМТ такта сжатия. Снимается клемма «массы» с аккумулятора и сливается охлаждающая жидкость. Демонтируется фильтр воздухозаборника. Отсоединяются колодка проводного жгута, свечи зажигания и провода, а также датчики падения давления масла и температуры жидкости охлаждения.

После всех этих несложных процедур можно заменить прокладку и подсоединить все агрегаты в обратном порядке.

Прежде чем заменить подшипник, необходимо снять коробку переключения передач и фиксатор муфты. Затем муфту можно извлечь из конструкции.

На автомобилях Лада Гранта подшипник в основном идет в сочетании с муфтой, но заменить можно и один подшипник. Для этого нужно будет разобрать саму муфту, отжав фиксирующие лапки любым подходящим инструментом.

Устанавливать подшипник нужно внимательно, учитывая наличие у него выступающей части, которая предназначена для удерживающего кольца. После устранения неисправности можно собрать коробку передач в обратной последовательности и установить все на свои места.

Особенности замены элементов сцепления

Для того чтобы провести замену вилки сцепления, нужно запастись пассатижами и отверткой. Для начала необходимо демонтировать подшипник включения и снять с рычага резиновый пыльник, который, пользуясь случаем, можно заменить на новый. Лепестки фиксатора прижать к основанию пассатижами и вынуть втулку из оси вилки, после чего удалить ось самой вилки из сжатой в картере втулки. С вилки снять пружинный фиксатор.

Замена троса сцепления

Если втулка подверглась значительному износу, ее можно заменить, пока вся система разобрана. В процессе монтажа недопустимо ослаблять втулку внутри паза, так как это может привести к ее выпадению. Собирать всю конструкцию следует в обратном разбору порядке.

Прежде чем приступить к работе со сцеплением, его следует отключить, отжав лепестки подходящим для этого инструментом. Замена троса выполняется в определенной последовательности.

  1. Под приборной панелью внутри салона нужно отвинтить гайку с упора.
  2. Отсоединить отверткой или другим подручным инструментом пластиковый корпус, который относится к стержню педали.
  3. Из тросовой оболочки и разъема в моторном отсеке вынуть уплотнитель, а трос вытащить вперед. Снять с его вилки выемки.
  4. От наконечника заменяемого троса открутить провод и удалить тросовую оболочку.
  5. Новый трос пропустить в отверстие щитка и зафиксировать на кронштейне.
  6. Зафиксировать на шпильке этого кронштейна упор и установить на место уплотнитель.
  7. В отверстие для кронштейна просунуть новый трос и поставить втулку.
  8. Накрутить провод на нижний наконечник.

Замена деталей тормозной системы

Ремонт тормозного цилиндра Гранта

Неисправности тормозной системы могут привести к плачевным последствиям, и чтобы этого избежать, нужно периодически проводить диагностику. Если поломки выявлены, их следует немедленно устранить. При наличии неисправностей автомобиль Лада Гранта не должен эксплуатироваться.

Признаки, по которым можно выявить плохую работу тормозных цилиндров:

  • потеки на грязезащитном кожухе свидетельствуют о том, что тормозная жидкость проходит через уплотнители и вытекает наружу;
  • машина не катится по инерции при заклинивании поршней.

Для замены тормозных цилиндров автомобиль следует установить в правильном положении, запустить нижнюю передачу и поставить упор под колеса. Открутить от цилиндра тормозную трубку и закрыть ее подручными средствами, чтобы предотвратить утечку тормозной жидкости. Отделить цилиндр от кожуха, сняв два болта. Новый цилиндр устанавливается в обратной последовательности.

При замене передних колодок на автомобиле Лада Гранта соблюдается такая последовательность действий.

  1. Прежде чем приступить к работе, нужно отключить аккумулятор. Определить уровень тормозной жидкости, и если она находится возле горла бачка — откачать. Отогнуть кромку нижнего болта стопорной шайбы.
  2. Выкрутить нижний болт тела скобы.
  3. Повернуть корпус скобы к оси болта.
  4. Вынуть колодки, отодвинув поршни механизма отверткой или другим подходящим предметом.
  5. Механизм прочистить и убрать бортик демонтажа колодок.
  6. Устанавливая новые колодки, поршень помещают в цилиндр, при этом постоянно контролируют уровень тормозной жидкости, не давая ей переливаться через край.

Задние тормозные колодки меняют после снятия барабана и демонтажа находящихся там шпилек.

  1. Снять верхнюю и нижнюю пружины стяжек и направляющую пружину от колодок.
  2. Удалить разжимную планку и отцепить рычаг от петли троса.
  3. Снять палец.

Установка новой задней колодки выполняется в обратном порядке.

Ремонт многих деталей автомобиля Лада Гранта можно выполнить самому. А для тех, кто раньше использовал другое транспортное средство от АвтоВАЗ и уже занимался устранением его неисправностей, это и вовсе не составит труда, так как многие детали и механизмы у вазовских машин идентичны.

Для Лада Гранта весьма актуален, ведь детища отечественного автопрома, как ни прискорбно, не радуют своих владельцев сверхнадежностью. Более того, отечественный автолюбитель явно не ищет легких путей, поэтому в большинстве случаев и решается на ремонт собственными руками. В связи с чем на просторах русскоязычного интернета существует своеобразный клуб автолюбителей-мастеров, где счастливые владельцы «Лада-Гранта» делятся опытом и секретами в этом непростом деле. Причем такой клуб не один.

Никто не станет спорить с тем фактом, что, приступая к такому ответственному делу, как ремонт собственного автомобиля своими руками, необходимо обладать хорошим багажом знаний по этой теме. Таким источником технической информации станет книга . В ней можно найти детальное описание очень большого количества технических проблем и поломок.

Правильная диагностика неполадки

Для начала нужно провести качественную диагностику неисправностей транспортного средства. Однако вряд ли клуб простых «ладоводов» имеет в гараже дорогостоящую аппаратуру для этого. Чтобы купить такое диагностирующее устройство, придется сильно потратиться. Да и стоит ли? Большинство автомобилистов делают выводы исходя из собственных ощущений и наблюдений за своим авто. Конечно, такой поверхностный анализ не может дать максимально точный вердикт, но, сверяясь с книгой по ремонту, можно довольно точно определить тип большинства , не прибегая к дорогостоящим услугам СТО.

Например, в этой книге вы найдете признаки неисправностей двигателя и прочих элементов агрегатной системы. Если вы заметили сильный шум при работе стартера, хлопки во впускной трубе, выстрелы в глушителе, сильную вибрацию двигателя или повышенный расход масла, то в вышеназванной книге будут указаны первые причины данных неполадок, а также приведены советы, которые помогут эти поломки исправить.

В этом своеобразном гиде вы найдете ответы и подсказки на многие вопросы. Например, коленчатый вал не проворачивается стартером, неустойчиво работает двигатель, перегрев агрегата — все эти и многие другие проблемы будут указаны в справочнике.

Вы найдете описание и решение проблем, связанных с ходовой частью автомобиля, трансмиссией, рулевым управлением и тормозной системой. Пробуксовывает сцепление, стуки при работе подвески, шум в момент переключения передачи, вибрации при движении авто, утечка масла — это короткий список тех проблем, которые описаны в книге.

Ремонт собственными руками

С диагностикой все понятно. Если обнаружить проблему и определить ее причину можно, то как быть, когда дело доходит до самостоятельного ремонта? Здесь вам пригодится помощь такой книги, как «Путеводитель по ремонту Лада-Гранта». Тут вам и ремонт двигателя, и сцепления, и коробки передач и многое другое. Вы сможете найти поэтапную, детальную и предельно ясную инструкцию, которая поможет вам в решении проблем разной сложности. Например, очень подробно в книге описывается как замена всевозможных датчиков, так и замена двигателя целиком. Кроме того, там вы найдете пошаговую инструкцию по ремонту тормозной системы, электрооборудования и многих других систем. Еще одним огромным преимуществом являются понятные, четкие и цветные иллюстрации. Все это существенно упростит вам процесс ремонта различных систем в автомобиле.

Такие пособия довольно легко можно найти во всемирной паутине, где они есть в свободном доступе для скачивания. Также не забывайте о сервисной книжке, которая прилагается самим производителем, там можно найти много полезной информации по ремонту «Лады». Видеоуроки являются просто бесценным материалом, поскольку дают возможность увидеть все в действии. Именно такой подход является наиболее эффективным для абсолютных новичков.

Конструктивные дефекты автомобиля можно исправить без СТО. Ремонт Лада Гранта своими руками осуществлять только после ознакомления с особенностями модели.

Лада Гранта (ВАЗ-2190) — российский автомобиль В класса. Выпуск модели начался в октябре 2011 года.

Лада Гранта создана на платформе Лада Калина 2004 года выпуска.

Модели имеют 70% одинаковых деталей и комплектующих. Технически Гранта почти не отличается от прародителя. Производители увеличили колёсную базу и колею задних колёс, вытянули переднюю часть автомобиля.

Модификации Лада Гранта

Лада Гранта выпускается в трёх модификациях.

  1. Стандарт. Самая дешёвая модификация модели. Выпускается с 82-сильным 8-клапанным двигателем. Из-за конструктивных особенностей у автовладельцев возникает неудобство вождения. Сложно управляем при разгоне. Возникают неполадки с трансмиссией и сцеплением.
  2. Норма. ВАЗ-2190 в комплектации «норма» оборудуют 8-клапанным силовым агрегатом мощностью 87 л. с. Рулевое управление оснащено электроусилителем руля и управляемой рулевой колонкой.
  3. Люкс. Комплектация отличается повышенной комфортностью салона и 98-сильным 16-клапанным двигателем.

Все модификации имеют отрицательный развал колёс.

Двигатели

Двигатели ВАЗ-2190 оснащены поршневой системой. При разрыве ремня ГРМ загибаются клапаны и происходит разрыв поршней. Важно своевременно производить диагностику силового агрегата.

Выход из строя генераторов — распространённая неисправность модели. Требуется замена генератора после 1000 км пробега.

Коробка переключения передач

После 20 000 км пробега КПП издаёт звон и начинает гудеть. Передачи переключаются без нареканий, но необходимо постоянно подтягивать тросик ручного тормоза.

Ходовая часть

Производитель устанавливает угол развала колёс задней подвески в 1 градус. В процессе эксплуатации не нужно производить регулировку. Ходовые характеристики Лада Гранта невысоки. Для улучшения характеристик требуется капитальный ремонт конструкции ходовой части.

Модификации Лада Гранта стандартно комплектуются покрышками Amtel Planet-2P. Покрышки отличаются низкими сцепными свойствами.

Салон

Салон Лада Гранта вместительный. Уровень шумоизоляции низкий — плохо собраны дефлекторы системы вентиляции. Отсутствует регулировка сидений по высоте, нет индикаторов температуры двигателя.

Доработка Лады Гранта

Для устранения заводских неполадок модели производиться тюнинг.

Технический тюнинг лучше начинить с исправления неполадок топливной системы. Нужно установить крепёжные кронштейны для топливной магистрали, зафиксировать гофры жгутами.

Тюнинг внешнего вида можно объединить с улучшением аэродинамических свойств авто и оборудовать Ладу Гранта обвесами.

: эксплуатация обслуживание ремонт — темы, которые волнуют всех автолюбителей, владеющих данным видом транспортного средства. Эта модель была выпущена для того, чтобы изменить мнение потребителей о продукции российского автопрома и Автоваза в частности.

Эксплуатация машины

Довольно прост в управлении, поэтому с таким делом может справиться даже новичок. Машина была выполнена на базе Lada Kalina, поэтому конфигурации этих двух моделей во многом схожи. Хорошо известная классика приобрела новые формы и теперь находит все больше и больше поклонников.

Машина достаточно хорошо работает при температурах от -30 до -50 градусов, что весьма удобно при нынешних зимах, особенно в северных регионах России.

Все сидения авто оснащены ремнями безопасности, надежно контролирующими положение пассажира. В автомобиле предусмотрено место для детского кресла, в котором обязательно должны перевозиться маленькие пассажиры.

Для автомобиля этой марки идеально подойдет топливо «Премиум-95» или «Премиум Евро-95». Не допускайте нулевой отметки на датчике! Это может привести к серьезной аварийной ситуации. Использованию кондиционера тоже необходимо уделить внимание. Следите за тем, чтобы машине не перегревалась. Охладительная система работает только при включенном двигателе, поэтому важно включать кондиционер хотя бы раз в месяц (для профилактики), если на улице — холодное время года.

Обслуживание Гранты

Техническое обслуживание автомобиля в жизни каждого сознательного водителя занимает важное место. Исключением не становится и Lada Granta, которая не является особенно требовательной, но все же нуждается во внимании со стороны хозяина. Самое главное правило, которое необходимо запомнить — вы должны осуществлять технический осмотр хотя бы раз в год, чтобы выявить все неполадки и устранить неисправности. Конечно, такая услуга стоит недешево, но она является гарантией вашей и пассажирской безопасности.

Вот некоторые задачи, которые стоят перед профессиональной станцией технического обслуживания:

  • Общий ремонт и обслуживание,
  • Замена масла и масляного фильтра,
  • Диагностика ходовой,
  • Прочистка радиатора,
  • Проверка тормозной системы.

В этот список могут входить и некоторые другие услуги, необходимые для автомобиля. Помните, что техническое обслуживание можно поручать только профессионалам, и лучше всего обратиться за помощью в центр производителя или региональное представительство. Мастера выдадут гарантию и талон нового образца.

Ремонт Lada Granta

Всегда волнуют водителей. Ведь любая неисправность, даже самая незаметная, может привести к аварийной ситуации и даже смерти. Ремонт можно осуществить как с помощью мастера, так и самостоятельно. Однако в решении проблем, связанных с двигателем, лучше всего поможет квалифицированный специалист. Помощь можно получить как на СТО, принимающих советские и отечественные автомобили, так и на станциях, где происходит замена элементов для иномарок. Все зависит только от ваших финансовых возможностей и предпочтений.

Не является слишком дорогостоящим. Все запчасти вы можете найти как в магазинах и на автобазарах, так и на официальном сайте производителя. Приобретение сертифицированной продукции обезопасит вас от дальнейших поломок. После ремонта любой сложности рекомендуется выехать на пустынную местность и провести тест-драйв. Это поможет определить, насколько машина готова к дальнейшим поездкам.

Для правильной работы автомобиля Лады важно не только проводить профессиональную диагностику, своевременно выполнять ремонт и обслуживание автомобиля, но и соблюдать некоторые правила, помогающие сохранить машину в отличном состоянии и застраховать вас от неожиданных неприятностей. В частности, смена масла должна осуществляться каждые 2000-5000 км или 1 раз в 6 месяцев. Используйте синтетику или полусинтетику.

Всегда пристегивайтесь и не оттягивайте ремни безопасности слишком сильно. Перед тем, как отправиться в далекое путешествие, посетите станцию обслуживания. Не бойтесь вызывать эвакуатор, если случилась поломка.

Всегда имейте страховку: в непредвиденной ситуации компания сможет оплатить часть расходов по восстановлению машины.

Как проводится первое ТО Лада Гранта Перечень необходимых работ по ТО 3 для Лады Гранты
Заводское руководство по эксплуатации и ремонту Лады Гранты

Lada Granta Краткая история Lada Granta

: техническое обслуживание техническое обслуживание ремонт — темы, волнующие всех автомобилистов, владеющих данным типом транспортных средств. Эта модель была выпущена для того, чтобы изменить мнение потребителей о продукции российского автопрома и АвтоВАЗа в частности.

Эксплуатация машины

Управлять довольно просто, поэтому с этим делом справится даже новичок. Машина сделана на базе Lada Kalina, поэтому комплектации этих двух моделей очень похожи.Известная классика обрела новые формы и теперь находит все больше и больше поклонников.

Машина достаточно хорошо работает при температуре от -30 до -50 градусов, что очень удобно в нынешние зимы, особенно в северных регионах России.

Все сиденья оборудованы ремнями безопасности, надежно контролирующими положение пассажира. В автомобиле предусмотрено место для детского кресла, в котором необходимо перевозить маленьких пассажиров.

Для автомобиля этой марки идеально подойдет топливо Премиум-95 или Премиум Евро-95.Не допускайте нулевой отметки на датчике! Это может привести к серьезной чрезвычайной ситуации. Использование кондиционера также требует внимания. Убедитесь, что машина не перегревается. Система охлаждения работает только при работающем двигателе, поэтому важно включать кондиционер хотя бы раз в месяц (для профилактики), если на улице холодно.

Сервисные гранты

Обслуживание автомобиля в жизни каждого сознательного водителя занимает важное место. Исключением не является Lada Granta, которая не особо требовательна, но все же требует внимания со стороны владельца.Самое главное правило, которое нужно помнить, это то, что вы должны проводить технический осмотр не реже одного раза в год для выявления всех проблем и устранения неисправностей. Конечно, такая услуга стоит недешево, но это гарантия вашей безопасности и безопасности пассажиров.

Вот некоторые проблемы, с которыми сталкивается профессиональная станция технического обслуживания:

  • Общий ремонт и техническое обслуживание,
  • Замена масла и масляный фильтр,
  • Запуск диагностики
  • Очистка радиатора,
  • Проверка тормозной системы.

В этот список могут входить некоторые другие услуги, необходимые для автомобиля. Помните, что техническое обслуживание могут проводить только профессионалы, а за помощью лучше всего обратиться в центр производителя или к региональному представителю. Мастера выдадут гарантию и талон нового образца.

Ремонт Lada Granta

Водители всегда волнуются. Ведь любая неисправность, даже самая незаметная, может привести к аварийной ситуации и даже к летальному исходу. Ремонт можно проводить как с помощью мастера, так и самостоятельно.Однако в решении проблем, связанных с двигателем, лучше всего поможет квалифицированный специалист. Справку можно получить как на СТО, принимающих советские и отечественные автомобили, так и на станциях, где производится замена элементов на иномарки. Все зависит от ваших финансовых возможностей и предпочтений.

Не слишком дорого. Все запчасти вы можете найти как в магазинах и авторынках, так и на официальном сайте производителя. Покупка сертифицированных продуктов защитит вас от дальнейшего ущерба.После ремонта любой сложности рекомендуется выехать в пустынную местность и провести тест-драйв. Это поможет определить, насколько автомобиль готов к будущим поездкам.

Для корректной эксплуатации автомобиля Лада важно не только проводить профессиональную диагностику, своевременный ремонт и техническое обслуживание автомобиля, но и соблюдать некоторые правила, которые помогают поддерживать автомобиль в отличном состоянии и уберечь от непредвиденных неприятности. В частности, замену масла следует проводить каждые 2000-5000 км или раз в 6 месяцев.Используйте синтетику или полусинтетику.

Всегда пристегивайте ремни безопасности и не затягивайте их слишком сильно. Прежде чем отправиться в дальнюю дорогу, посетите СТО. Не бойтесь вызывать эвакуатор в случае поломки.

Всегда иметь страховку: в непредвиденной ситуации компания сможет оплатить часть стоимости восстановления машины.

Как проходит первое ТО Лада Гранта Перечень необходимых работ по ТО 3 на Лада Гранта
Заводское руководство по эксплуатации и ремонту Лада Гранта

Абсолютно все ждали появления этого автомобиля, точнее даже не его самого, а информации о нем. Более того, они ждали даже тех, кто ни при каких обстоятельствах даже не думал о его покупке. Удивлен? Ведь речь идет не о баснословно дорогом суперкаре или очередном премиальном внедорожнике. Это очень дешевый компактный автомобиль. О Лада Гранта Лифтбэк.

Чем вызван такой интерес к довольно обычному автомобилю с точки зрения мирового автопрома? Исключительный внешний вид Lada Granta Liftback . Дошло до того, что многие журналисты и автоэксперты окрестили Гранту Лифтбек самым красивым отечественным автомобилем.И в этих смелых заявлениях есть доля правды. Если сравнивать Гранту с привычными Приорами и Калиной, то она действительно красиво смотрится на их фоне. Но Гранту Лифтбек сейчас тоже не зазорно сравнить с иномарками. А все благодаря идеально подобранным пропорциям. Это именно то, чего раньше не хватало отечественным автомобилям. И дизайнерам было не так-то просто добиться того, чтобы их работа радовала глаз. Ради привлекательного внешнего вида пришлось изменить форму некоторых кузовных панелей, что явно не понравилось инженерам и технологам. Но заводчане пошли на такой шаг. И все ради покупателей.

Претензий нет, если не забывать о стоимости автомобиля, и к салону. И хотя все сделано из дешевого жесткого пластика, но с точки зрения дизайна все не так уж и плохо. Симпатичный трехспицевый руль, лаконичная комбинация приборов, показания которой считываются за секунды, скромные, но вполне удобные блоки управления аудиосистемой и микроклиматом – все это предложит Granta Liftback даже в далеко не самой богатой комплектации. .Ну а если доплатить, то можно полюбоваться большим цветным дисплеем, который займет большую часть передней панели.

На задних сиденьях Lada Granta Liftback места ровно столько же, сколько в седане. Только подъемник стал буквально на пару сантиметров меньше, но пассажиры среднего роста вряд ли смогут это почувствовать. А даже если и могут, то не стоит винить в этом создателей автомобиля. Красота требует жертв, и ради такой красоты пожертвовать небольшим уменьшением пространства над головой не только можно, но и нужно. Ради дизайна пожертвовал и багажник. Вернее, не сами по себе, а доступом к нему. Красивые задние фонари немного сузили проем багажника. Стало ли хуже? Напротив! Ведь это не седан, а лифтбек, у которого поднимается не маленькая крышка багажника, а все заднее стекло. Доставка огромных коробок проще некуда. Да и сам объем багажника удовлетворит практически любого автолюбителя – 430 литров. А если сложить спинки задних сидений, то в вашем распоряжении окажется и вовсе 750 литров свободного места.

И если в плане дизайна Гранта Лифтбек здорово отличается от автомобиля с кузовом седан, то в техническом плане изменений гораздо меньше. Так что двигатели нам уже знакомы. Базовым является 1,6-литровый бензиновый восьмиклапанный агрегат, развивающий 87 лошадиных сил. С ним предлагается только механическая коробка передач. А вот с более мощной 1,6-литровой «шестнадцатиклапанником», выдающей 98 или 106 «лошадок», можно заказать не только «механику», но и коробку-автомат.

Управляется Lada Granta Liftback пусть и не идеально, но достойно. Его можно сравнить с бюджетными иномарками. Но будущий владелец должен знать, что от комплектации автомобиля во многом будет зависеть управляемость и уровень комфорта. Если вы выберете самую дорогую комплектацию, в которой, помимо всего прочего, будут шикарные легкосплавные диски с низкопрофильной резиной, то будьте готовы, что машине будет достаточно жестко преодолевать все неровности. Но управляемость хорошая. А вот на базовых штампованных дисках и высокопрофильной резине Granta Liftback идеально подходит для регионов, которые пока не могут похвастаться идеально ровными дорогами.Энергоемкость подвески не держит, а высокопрофильная резина избавит от постоянных толчков от мелких неровностей.

Новая Лада 2170

прочно занял свое место на отечественном рынке автомобилей и находится в авангарде по объему годовых продаж. Новый АвтоВАЗ порадовал любителей комфортных поездок не слишком большими затратами. Прототип бюджетной иномарки более доступен для российского потребителя, но, возможно, не так долговечен.

Продукция отечественного автопрома выгодна тем, что в случае поломки и необходимости замены детали ее легко можно найти на любом авторынке.Если у вас есть автомобиль Лада Гранта, ремонт своими руками можно произвести в собственном гараже, без дополнительных затрат на автосервисы. Главное – наличие подходящих инструментов.

Грустно, но ничто не вечно. А у автомобилей Лада Гранта бывают мелкие неисправности и крупные поломки. Какой ремонт можно сделать самому, не прибегая к помощи профессиональных мастеров?

Замена поврежденных автозапчастей

Демонтаж маховика проводится в нескольких случаях: замена заднего сальника, поломка зубчатого венца, для шлифовки поверхности маховика под диск сцепления.Сначала нужно снять коробку передач. Для удобства дальнейшей сборки деталей рекомендуется отметить расположение коленчатого вала и маховика.

Вытяните болты, удерживающие маховик, удерживая устройство так, чтобы оно не двигалось. Состояние зубов оценивают визуально. На поверхности не должно быть заусенцев. Для удобства оценки рекомендуется проводить на поверхности пальцем. Неисправный маховик заменяется новым, деталь возвращается на место.

Прокладка предохраняет двигатель от вытекания моторного масла и охлаждающей жидкости, и заменяется новой не только при ее повреждении, но и при каждом вмешательстве в блок цилиндров, так как считается одноразовой.

Замену удобнее всего проводить сразу после остановки автомобиля, в это время давление значительно снижается. Поршень первого цилиндра устанавливается в положение ВМТ такта сжатия. Клемма заземления снимается с аккумулятора, охлаждающая жидкость сливается.Фильтр воздухозаборника снят. Отсоединяются колодка жгута проводов, свечи зажигания и провода, а также датчики падения давления масла и датчики температуры охлаждающей жидкости.

После всех этих нехитрых процедур можно заменить прокладку и снова соединить все узлы в обратном порядке.

Перед заменой подшипника необходимо снять коробку передач и блокировку сцепления. Затем муфту можно снять с конструкции. На автомобилях Lada Granta подшипник в основном совмещен со сцеплением, но можно заменить и один подшипник.Для этого потребуется разобрать саму муфту, сжав стопорные выступы любым подходящим инструментом.

Подшипник необходимо устанавливать осторожно, учитывая наличие выступающей части, которая предназначена для стопорного кольца. После устранения неисправности можно собирать коробку передач в обратном порядке и устанавливать все на свои места.

Особенности замены элементов сцепления

Для замены вилки сцепления необходимо запастись пассатижами и отверткой.Для начала нужно демонтировать подшипник включения и снять с рычага резиновый чехол, который, пользуясь случаем, можно заменить на новый. Прижать плоскогубцами лепестки фиксатора к основанию и снять втулку с оси вилки, затем снять ось самой вилки со втулки, сжатой в картере. Снимите пружинный зажим с вилки.

Замена троса сцепления

Если втулка подверглась значительному износу, ее можно заменить при разборке всей системы. При установке недопустимо ослаблять втулку внутри паза, так как это может привести к ее потере. Соберите всю конструкцию в обратном порядке.

Перед началом работы со сцеплением его следует отсоединить, сжав лепестки подходящим инструментом. Замена кабеля осуществляется в определенной последовательности.

  1. Под приборной панелью внутри салона открутить гайку от упора.
  2. С помощью отвертки или другого подручного инструмента отсоедините пластиковый корпус, который относится к валу педали.
  3. Снимите прокладку с оболочки троса и разъема в моторном отсеке и протяните трос вперед. Снимите выемку с его заглушки.
  4. Открутите провод от наконечника заменяемого кабеля и снимите оболочку кабеля.
  5. Проденьте новый кабель в отверстие экрана и закрепите его на кронштейне.
  6. Закрепите стопор на штифте этого кронштейна и переустановите уплотнение.
  7. Вставьте новый трос в отверстие для кронштейна и наденьте втулку.
  8. Накрутите провод на нижний наконечник.

Замена деталей тормозной системы

Ремонт тормозного цилиндра Grant

Отказы тормозной системы могут привести к плачевным последствиям, и во избежание этого необходимо периодически проводить диагностику. При выявлении поломок их следует немедленно устранить. При возникновении неисправностей автомобиль Лада Гранта эксплуатировать нельзя.

Признаки, по которым можно определить плохую работу тормозных цилиндров:

  • течи на брызговике свидетельствуют о том, что тормозная жидкость проходит через уплотнения и вытекает наружу;
  • машина не катится по инерции при заклинивании поршней.

Для замены тормозных цилиндров автомобиль следует установить в правильное положение, включить пониженную передачу и поставить упор под колеса. Открутите тормозную трубку от цилиндра и закройте ее подручными средствами, чтобы предотвратить утечку тормозной жидкости. Отделите цилиндр от корпуса, отвернув два болта. Новый цилиндр устанавливается в обратном порядке.

При замене передних колодок на автомобиле Лада Гранта соблюдается такая последовательность действий.

  1. Перед началом работы необходимо отключить аккумулятор.Определить уровень тормозной жидкости и, если она находится у горловины бачка, откачать ее. Отогните край нижнего болта стопорной шайбы.
  2. Открутить нижний болт корпуса кронштейна.
  3. Поверните корпус кронштейна к оси болта.
  4. Снимите колодки, надавив на поршни механизма отверткой или другим подходящим предметом.
  5. Механизм для очистки и снятия щита демонтажа колодок.
  6. При установке новых колодок поршень помещают в цилиндр, при этом постоянно контролируют уровень тормозной жидкости, не допуская ее перелива.

Задние тормозные колодки меняются после снятия барабана и удаления расположенных там шпилек.

  1. Снимите верхнюю и нижнюю соединительные пружины и направляющую пружину с колодок.
  2. Снимите расширительный стержень и отсоедините рычаг от тросовой петли.
  3. Убери палец.

Установка новой задней колодки выполняется в обратном порядке.

Многие детали автомобиля Лада Гранта можно отремонтировать самостоятельно. А для тех, кто ранее пользовался другим транспортным средством от АвтоВАЗа и уже занимался устранением его неисправностей, это совсем не составит труда, так как многие детали и механизмы автомобилей ВАЗ идентичны.

Этот автомобиль одним из последних сошёл с конвейера ВАЗ, сменив полюбившиеся многим Lada Kalina и Lada Samara. Модель смогла быстро поразить несколько достойных признаков. Обновленный автомобиль по многим позициям отличается от выпускавшихся до него аналогов, выглядит достаточно привлекательно среди модельного ряда отечественного автопрома.

  Преимущества автомобиля

Счастливчики, владеющие таким автомобилем, считают главными его достоинствами комфорт и простор салона, качественную сборку, привлекательный дизайн:

Хочется отметить, что базовая комплектация автомобиля отличается своим обилием, несмотря на то, что цены на автомобиль определялись с учетом денежных возможностей средних слоев населения:

Для разработки автомобиля за основу была взята всем известная платформа Kalina. Процесс модернизации оставил в первозданном виде только дверь, полностью изменив кузовную часть. Изменения не коснулись багажного отделения, увеличив его объем до пятисот литров:

Машина по праву считается надежным транспортным средством, но иногда случаются характерные для данного модельного ряда поломки. По этой причине, решив приобрести такой автомобиль, рекомендуется уточнить, сколько можно отремонтировать Лада Гранта своими руками.

Внешний вид автомобиля – важная вещь, о которой заботится любой владелец транспортного средства.Но от царапин никто не застрахован, и следует знать, как правильно с ними бороться, чтобы не начала образовываться ржавчина.

В общих чертах схема работы следующая:


Текущий ремонт

Основное отличие автомобиля — отсутствие опорного ролика на двигателе. Эта особенность вызывает большое количество неприятных моментов. Предлагаем более наглядно изучить порядок замены маховика при замене задних сальников, выходе из строя зубчатого венца или при притирке.
  Сначала нужно демонтировать коробку передач. Далее для облегчения работы по предстоящей сборке следует разметить размещение маховика и коленчатого вала. Теперь разрешается снимать держатель маховика, но основной элемент должен оставаться неподвижным.

К климатическому оборудованию машины следует подходить осторожно, кондиционер включать только при работающем двигателе, а при запотевании стекол включать вентилятор на пониженной скорости.

Не ленитесь проходить диагностику, проводите регулярное техническое обслуживание машины.Эти меры помогут вам избежать серьезных неприятностей и, как следствие, значительных финансовых затрат.

Обоснование цены и обоснование источника

Последнее обновление: 15 июля 2020 г. 13:26:54 PDT

Узнайте, что требуется профессиональному покупателю, в разделах «Обоснование цены» и «Обоснование источника» формы в Oracle.

Определения

Обоснование цены:

Документация путем обзора, анализа или изучения цены, предложенной поставщиком, и оценка или оценка того, является ли она справедливой и разумной. Определить, является ли цена покупки разумной, можно с помощью : Официальная конкуренция, Котировки, Предыдущие/исторические цены, Опубликованные цены, и Знание рынка .

Обоснование источника:

Документация, необходимая, если для закупки не был выбран участник с самой низкой ценой или самая низкая цена, представленная поставщиком. Рекомендация поставщика с более высокой ценой может быть объяснена одним или комбинацией следующих пунктов: Непрерывность исследований, Уникальный дизайн, Совместимость, Единственный в своем роде, Университетские стандарты, Дата поставки,   Экстренный вызов и Запасная часть .

Когда официальный запрос цен на товар и/или услугу обнародуется, и поставщики представляют предложение на основе того, что запросил клиент; это обычно используется для заказов, равных или превышающих 100 000 долларов США

Запрос предложений (RFP) — это официальное приглашение потенциальным поставщикам с просьбой представить предложение с изложением того, как они могут удовлетворить потребность в товарах и/или услугах.RFP также позволяет нам проверить квалификацию, опыт и подход поставщика, которые обеспечат наилучшее решение.

Запрос коммерческого предложения  – это официальный письменный запрос к потенциальным поставщикам на предоставление коммерческого предложения на товары и/или услуги. В отличие от процесса запроса предложений, победитель определяется ТОЛЬКО по цене. Существуют ограниченные критерии, используемые для оценки качества продукции или услуг поставщика.

Запрос информации (RFI) — это процесс сбора письменной информации о возможностях различных поставщиков.Он в основном используется для сбора информации, чтобы помочь принять решение о том, какие шаги предпринять дальше. RFI часто используются в сочетании с RFP или RFQ. В дополнение к сбору базовой информации, RFI часто используется в качестве приглашения, рассылаемого широкому кругу потенциальных поставщиков с целью формирования их мнения, разработки стратегии, создания базы данных и подготовки к RFP или RFQ.

Определение:

Ценовые документы от поставщиков, предлагающие цену на запрашиваемые товары и/или услуги, которые могут помочь потенциальному покупателю при принятии решения о том, у кого покупать и какие услуги ему нужны.

Хороший пример:

  • Заявитель Калифорнийского университета в Сан-Диего прикладывает как минимум 3 письменных предложения от разных поставщиков на одни и те же или аналогичные товары и/или услуги.

Неверный пример:  

  • Цены на товары и/или услуги были получены устно от 3-х поставщиков.
  • Получены расценки на несопоставимые (аналогичные или близкие) товары и/или услуги, причем настолько разные, что в исходном обосновании невозможно объяснить, почему выбрано более дорогое ценообразование.

Полезные советы:

  • Приложите как минимум 3 письменных ценовых предложения, включая выбранное предложение. Убедитесь, что в предложениях указаны одинаковые или похожие товары и/или услуги.
  • Если самая низкая цена не выбрана, используйте раздел обоснования источника, чтобы объяснить, почему покупка осуществляется у поставщика, предлагающего более высокую цену.

Определение:

Когда одни и те же или похожие товары и/или услуги приобретались один или несколько раз в прошлом и указанные цены сопоставимы.

Хороший пример:

  • Предыдущие номера заказов на покупку и цены указаны для тех же или аналогичных товаров и/или услуг, которые приобретаются. Если котировка выше ранее закупленной цены, это объясняется в исходном обосновании.
    • «Аналогичный товар, ранее приобретенный по заказу на поставку 300 по цене 308 079,00 долларов США».

Неверный пример:

  • Указанный номер заказа на поставку не относится к тем же или аналогичным товарам и/или услугам.
  • Флажок «Предыдущая цена» установлен, но номер заказа на поставку не указан.

Полезные советы:

  • Перечислите все прошлые заказы на покупку тех же или аналогичных товаров и/или услуг вместе с предыдущими ценами.
  • Если вы указываете предыдущую цену, которая ниже выбранной, объясните разницу в цене, сравнив прошлые покупки с тем, что покупается в настоящее время, в разделе обоснования источника.

Определение:

Полученные котировки поставщиков, которые сравниваются с каталогом или установленными прайс-листами, рыночными ценами или сопоставимыми ценами, предлагаемыми федеральному правительству.

Хороший пример: 

  • При заполнении iRequest Marketplace приложите каталог поставщиков, прайс-лист, рыночные цены или государственные цены из Интернета.
    • Калифорнийский университет в Сан-Диего получает скидку 35% от первоначальной цены производителя на деталь № 4465958. Цена GSA на самую дорогую деталь № 4465958 составляет 366 045,34 долларов США, а цена Калифорнийского университета в Сан-Диего — 337 350,00 долларов США. См. приложение «GSA»
    • . Цена
    • GSA, только для самой дорогой детали № 4465958, составляет 366 045 долларов.34 и UC San Diego цена составляет 337 350,00 долларов США. См. приложение «GSA»
    • .

Неверный пример: 

  • Когда несколько поставщиков предлагают товары и/или услуги, но Калифорнийский университет в Сан-Диего делает одно предложение, когда поставщик предлагает скидку

Полезные советы:

  • Каталог или прайс-лист – это получение коммерческого предложения, которое сравнивается с тем, что продавец публично опубликовал или установил в качестве прайс-листа 
  • Рыночное ценообразование – это получение цен на то, что другие поставщики продают за свои товары и/или услуги
  • Цены федерального правительства доступны в Интернете для многих товаров и услуг
  • Приложите каталоги конкурирующих поставщиков, прайс-листы и рыночные цены, и, если выбранная цена превышает цену конкурентов, объясните, почему в исходном обосновании выбрана более дорогая цена

Определение:

Ценообразование основано на предыдущей конкуренции, сравнении с аналогичным товаром, продажах того же товара другим университетам или компаниям, оценках независимых университетов (собственных) и ценах из торговых журналов или торговых выставок.

Хороший пример: 

  • Прикрепление котировок из предыдущих запросов предложений на те же или аналогичные товары и/или услуги 
  • Получение письменных ориентировочных цен от поставщиков во время посещения торговой выставки
  • Предложения об аналогичной покупке со стороны PI в 2009 г. в Университете Иллинойса
    • Carl Zeiss — 105 101,15 долл. США 
    • Олимп — $121 309,92
    • Никон — $131 964,79

Неверный пример: 

  • Только поставить галочку, но без подтверждающей документации
  • Заявление «это лучший продукт на рынке» или «это единственные ребята, которые могут его поставить», но не предоставление подтверждающей документации — эти примеры говорят об обосновании источника, а не о цене

Полезные советы:

  • При поиске и поиске поставщиков товаров и/или услуг всегда получайте письменные цены от поставщиков, даже если это предварительные цены.Или сохраните все цены, которые вы найдете в отраслевом журнале, или цены, предоставленные вам на торговой выставке.

Определение:

Обеспечение того, чтобы проводимое исследование не было прервано, затронуто или изменено введением другого товара и/или услуги, которые нарушат непрерывность исследования.

Хороший пример: 

  • Этот инструмент необходим для обеспечения непрерывности исследований благодаря улучшенным возможностям по сравнению с существующим, ныне устаревшим инструментом с аналогичной функциональной ролью.Наши исследования все чаще требуют соблюдения федеральных и FDA руководящих принципов для фармацевтического биоанализа, который не может быть выполнен на нашей существующей (устаревшей) масс-спектрометрической системе.
  • В наших амбулаторных отделениях наличие надлежащего радиологического оборудования является ключевым элементом нашей способности предоставлять высококачественные услуги, которые от нас ожидают. Этот конкретный элемент оборудования имеет соответствующий уровень сложности и калибра, необходимый для удовлетворения и обеспечения потребностей в обслуживании, с которыми часто сталкивается наша команда экспертов (лицензированный персонал в области радиологии)
  • .

Полезные советы:

  • Полезно спросить себя: почему этот товар и/или услуга необходимы для сохранения или работы с вашими текущими данными и получения будущих данных, которые считаются достоверными в ваших исследованиях?

Определение:

Рассмотрение формы (форма, размер, размеры и масса), приспособления (физический интерфейс или взаимосвязь с другими элементами или сборкой) и функции (действия, для выполнения которых предназначен элемент) предмета по сравнению с другими предметами.

Хороший пример:

  • Может обеспечивать ударную нагрузку с помощью молота до 15 кг, а скорость удара может быть выше 20 м/с. Линейная точность составляет 0,5%. Будет система хранения образцов для предотвращения подпрыгивания.
  • Будет закуплено и собрано несколько предметов для создания центра обработки изображений FRET:
    • Nikon Inverted Microscope, инвертированный исследовательский микроскоп от Nikon, был разработан для обеспечения максимальной гибкости в методах исследования живых клеток и реализован как полностью интегрированная исследовательская платформа для наблюдения и анализа клеток, особенно для получения флуоресцентных изображений.Он имеет функции для всех нужд нашего проекта, особенно
    • .
      1. идеальная система фокусировки, которая может поддерживать плоскость фокусировки с высокой точностью и, следовательно, обеспечивает надежное измерение FRET,
      2. высокочувствительная камера для визуализации FRET,
      3. моторизованный столик с высокой точностью для эффективной и автоматизированной идентификации клеток,
      4. три колеса фильтров для фильтров возбуждения, эмиссии и нейтральной плотности, контроллер колеса фильтров и другие оптические элементы.

Полезные советы:  

  • Используйте форму и функцию в качестве ориентира:
    • Форма: форма, размер, габариты и масса оборудования
    • Функция: соответствует ли требуемым спецификациям и характеристикам

Определение:

Приобретаемые товары могут работать с другим товаром без проблем; он предназначен для работы или работы с другим товаром или системой без модификации.

Хороший пример:

  • Мы связались с парой конкурентов Instron для покупки тестера на удар. Продукт МТС может быть более высокого качества, но он кажется более хрупким, не подходящим для лабораторной среды, где машина будет использоваться в основном неопытными студентами; кроме того, цена МТС намного выше как минимум на 30% (согласно телефонному разговору с инженером по продажам МТС), а программное обеспечение несовместимо с имеющимся в нашей лаборатории тестером Instron.Другие потенциальные поставщики находятся в Китае; качество их продукции не соответствует нашим требованиям, и могут возникнуть обременительные проблемы с импортом. Продукт Instron имеет хороший баланс производительности и стоимости. Его программное обеспечение совместимо с существующими тестерами в нашей лаборатории, создавая непрерывную линию тестирования.
  • Этот элемент оборудования представляет собой датчик движения для взаимодействия с многолучевым гидролокатором, установленным на ледоколе USCG HEALY, Kongsberg EM122. SeaPath 330+ — это самая современная модель датчика движения на рынке, и он от того же производителя хорошо работает с многолучевым датчиком EM122, например.грамм. форматы данных совместимы.

Полезные советы: 

  • Используйте посадку в качестве ориентира:
    • Соответствие: насколько хорошо хороший интерфейс или взаимосвязь с другими товарами, системой или сборкой 

Определение:

Существует только одно лицо или компания, которые могут предоставить необходимые товары и/или услуги, поэтому любая попытка получить предложения приведет к тому, что только одно лицо или компания будут иметь право участвовать в торгах; это также известно как «единственный источник».”

Хороший пример:

  • Микроскоп Nikon Ti-E является единственной моделью, которая может обеспечить идеальную систему фокусировки, позволяющую сохранять плоскость фокусировки во время визуализации живых клеток. Подробная информация прилагается следующим образом:
    • Nikon Ti – E с системой Perfect Focus
    • Nikon Ti-E — это первый полностью автоматизированный инструмент крупного производителя микроскопов, способный выполнять быстрое и надежное (среднее время наработки на отказ приводов — миллионы циклов) многорежимное сканирование целых титрационных микропланшетов и предметных стекол.В сочетании с программным обеспечением для получения изображений NIS-Elements, Ti-E поддерживает различные методы визуализации, такие как многомерная цейтраферная визуализация, для получения временной, пространственной и спектральной информации о быстрых, динамических процессах живых клеток. Интеллектуально спроектированная автоматизация (высокоскоростной моторизованный револьвер, флуоресцентные фильтры, затворы, револьверная головка конденсора и предметный столик X-YZ) и дальнейшее расширение мощного модульного подхода Nikon делают Ti-E идеальным для таких приложений, как взаимодействие молекул флуоресцентного белка в живых клетках. и тканей.

Неверный пример:

  • Заявление «они единственные, кто производит это оборудование или может предоставить эту услугу», но не предоставление подтверждающей документации

Полезные советы: 

  • Это единственный источник, который не исключает и не исключает необходимости заполнения обоснования цены

Определение:

Приобретаемые товары и/или услуги должны соответствовать требованиям, критериям или спецификациям, установленным Университетом.

Хороший пример:

  • Стулья Campus должны соответствовать эргономическим требованиям, установленным EH&S
  • .
  • Краска, используемая на территории кампуса, должна соответствовать обозначенному коду краски
  • .

Полезные советы: 

  • Обычно используется для покупок, связанных с объектами. Другие случаи включают требования о страховании, требования об ответственности или права на публикацию.

Определение:

Только один поставщик может уложиться в сроки поставки закупаемого товара.

Хороший пример:  

  • Во время формального конкурса только один поставщик мог уложиться в сроки поставки 

Неверный пример: 

  • Отделение кампуса знало о необходимости закупки оборудования в течение 6 месяцев, но подавало заявку только за 2 недели до ее возникновения

Полезные советы: 

  • Прикрепите документацию, указывающую требуемую дату выполнения, и получите предложения от различных поставщиков, которые показывают время выполнения заказа/время доставки.

Определение:

Срочная потребность в товарах и/или услугах.

Хороший пример: 

  • Повреждение оборудования делает его не подлежащим ремонту, что ставит под угрозу сбор исследовательских данных, и только у одного поставщика есть оборудование на складе после проверки рынка.
  • В настоящее время в моей лаборатории научно-технического исследовательского центра (SERF 287), UCSD имеется доступный микроскоп FRET.Однако из-за характера нашей визуализации живых клеток каждое наблюдение за отдельной клеткой занимает много времени, обычно несколько часов. Таким образом, этот микроскоп FRET полностью зарегистрирован и постоянно используется для удовлетворения потребностей моей лаборатории и сотрудников. Действительно, существующий микроскоп использовался более 60 часов каждую неделю в течение последних трех лет. Несмотря на это, каждому члену лаборатории может быть разрешено регистрироваться только на 1 день использования каждые 10 дней, поскольку более десяти человек используют эту область в проектах по созданию изображений.Это узкое место моей лаборатории, которое значительно ограничивает нашу производительность. Эксперименты с визуализацией FRET, предложенные в моих грантах, создадут серьезную проблему для использования микроскопа, учитывая временные ограничения области применения. Кроме того, этот прицел интенсивно и непрерывно использовался более трех лет, что приводило к частым нуждам в ремонте и перерывам в экспериментах. Все это еще больше ограничит нашу производительность и затормозит продвижение нашего проекта. Настоящим мы предлагаем установить второй микроскоп FRET, чтобы расширить наши возможности и повысить эффективность наших экспериментов.

Плохой пример:

  • Отдел кампуса знал о необходимости приобрести товар и/или услугу в течение 6 месяцев, но подавал заявку только за 2 недели до того, как это стало необходимо, и только один поставщик может поставить по более высокой цене.

Полезные советы: 

  • Предоставить документацию, объясняющую срочную необходимость

Определение:

Элемент, который является частью общего оборудования или системы, нуждается в замене, и только производитель оригинального оборудования производит и распространяет элемент

Хороший пример: 

  • Сломалась подставка у микроскопа компании XYZ — вы узнаете, что подставка специфична для микроскопа, а подставку делает только компания XYZ

Неверный пример: 

  • Подставка на универсальном микроскопе ломается, и есть несколько компаний, которые могут поставить подставку, но вы выбираете первую, не обращая внимания на других поставщиков.

Полезные советы: 

  • Предоставить документацию, подтверждающую, что запасная часть может поставляться только производителем оригинального оборудования или из одного источника

Усовершенствованная диагностика рака на основе микроРНК с использованием амплифицированного FRET с временным стробированием

Chem Sci.2018 14 ноября; 9(42): 8046–8055.

, A , A , A , A , A , B , C , D , E , E , F , г, H , G , G , E, , E, I, J , D, , K , B, C и A

Nikiforos-Ioananis Kapetanakis

B Гюстав Русси , Университет Париж-Сакле , CNRS , УМР 8126 , Вильжюиф , Франция

в Университет Париж-Юг , Университет Париж-Сакле , Ле Кремль-Бисетр , Франция

Изабель Дюру-Ришар

d IRMB , ИНСЕРМ , Университет Монпелье , Монпелье , Франция

Юлия Дж.Унтерлаггауэр

и Диагностический и научно-исследовательский институт патологии , Диагностический и научный центр молекулярной биомедицины , Медицинский университет Граца , Австрия

Николь Голоб-Шварцль

e Диагностический и научно-исследовательский институт патологии , Диагностический и научный центр молекулярной биомедицины , Медицинский университет Граца , Австрия

Кристоф Режар

f Laboratoire de Génomique et Biodiversité Microbienne des Biofilms (LGBMB) , Институт интегративной биологии клетки (I2BC) , Университет Париж-Сакле , Университет Париж-Юг , CNRS , СЕА , Орсе , Франция

Екатерина Узан

г Кафедра хирургии , Гюстав Русси , Университет Париж-Сакле , Вильжюиф , Франция

ч Отделение грудной клетки и гинекологической хирургии , Больница Питье Сальпетриер , АПХП , Университетский институт рака , Сорбоннский университет , ИНСЕРМ U938 , Франция

Себастьян Гуи

г Кафедра хирургии , Гюстав Русси , Университет Париж-Сакле , Вильжюиф , Франция

Майкл Дюбоу

f Laboratoire de Génomique et Biodiversité Microbienne des Biofilms (LGBMB) , Институт интегративной биологии клетки (I2BC) , Университет Париж-Сакле , Университет Париж-Юг , CNRS , СЕА , Орсе , Франция

Йоханнес Хайбек

и Диагностический и научно-исследовательский институт патологии , Диагностический и научный центр молекулярной биомедицины , Медицинский университет Граца , Австрия

и Кафедра патологии , Магдебургский университет им. Отто фон Герике , Германия

и Кафедра патологии , Медицинский университет Инсбрука , Австрия

Флоренция Apparially

d IRMB , ИНСЕРМ , Университет Монпелье , Монпелье , Франция

к Клиническое отделение костно-суставных заболеваний , Университетская клиника Монпелье , Монпелье , Франция

Пьер Бюссон

б Гюстав Русси , Университет Париж-Сакле , CNRS , УМР 8126 , Вильжюиф , Франция

в Университет Париж-Юг , Университет Париж-Сакле , Ле Кремль-Бисетр , Франция

б Гюстав Русси , Университет Париж-Сакле , CNRS , УМР 8126 , Вильжюиф , Франция

в Университет Париж-Юг , Университет Париж-Сакле , Ле Кремль-Бисетр , Франция

д IRMB , ИНСЕРМ , Университет Монпелье , Монпелье , Франция

и Диагностический и научно-исследовательский институт патологии , Диагностический и научный центр молекулярной биомедицины , Медицинский университет Граца , Австрия

ф Laboratoire de Génomique et Biodiversité Microbienne des Biofilms (LGBMB) , Институт интегративной биологии клетки (I2BC) , Университет Париж-Сакле , Университет Париж-Юг , CNRS , СЕА , Орсе , Франция

г Кафедра хирургии , Гюстав Русси , Университет Париж-Сакле , Вильжюиф , Франция

ч Отделение грудной клетки и гинекологической хирургии , Больница Питье Сальпетриер , АПХП , Университетский институт рака , Сорбоннский университет , ИНСЕРМ U938 , Франция

и Кафедра патологии , Магдебургский университет им. Отто фон Герике , Германия

и Кафедра патологии , Медицинский университет Инсбрука , Австрия

к Клиническое отделение костно-суставных заболеваний , Университетская клиника Монпелье , Монпелье , Франция

Автор, ответственный за переписку.

Поступила в редакцию 14 июля 2018 г .; Принято 10 сентября 2018 г.

Авторские права Этот журнал © The Royal Society of Chemistry 2018

Эта статья находится в свободном доступе. Эта статья находится под лицензией Creative Commons Attribution 3.0 Unported License (CC BY 3.0)

Эта статья цитировалась в других статьях в PMC.
Дополнительные материалы
Дополнительные данные

GUID: D24B5271-0C92-4BB3-9747-726503F61877-726503F61877-726503F61870

Заявление о наличии данных

Все исходные данные усиленных измерений TG-FRET и RT-QPCR и все остальные соответствующие данные можно получить у соответствующего автора по запросу.

Abstract

МикроРНК (миРНК) играют важную роль в клеточных функциях, а также в развитии и прогрессировании рака. Точная количественная оценка эндогенных микроРНК из разных клинических образцов пациентов и контрольных образцов в сочетании со сравнением один к одному со стандартными технологиями является сложной, но необходимой задачей, которой в значительной степени пренебрегают многие новые флуоресцентные технологии. Здесь мы представляем простой, точный, чувствительный и специфичный логометрический анализ для абсолютного количественного определения микроРНК.Изотермически амплифицированный резонансный перенос энергии Фёрстера во времени (TG-FRET) между донорами Tb и акцепторами красителя привел к анализам микроРНК со специфичностью однонуклеотидного варианта и пределами обнаружения до 4,2 ± 0,5 аттомолей. Количественное определение миР-21 из тканей и образцов плазмы человека показало ее актуальность для диагностики рака молочной железы и яичников. Анализ miR-132 и miR-146a из клеток острого моноцитарного лейкоза (THP-1) продемонстрировал широкую применимость к различным микроРНК и другим типам клинических образцов.Прямое сравнение с золотым стандартом RT-qPCR показало преимущества амплифицированного TG-FRET в отношении точности и специфичности при количественном определении низких концентраций микроРНК, что требуется для диагностических приложений. Наши результаты показывают, что тщательное внедрение амплификации по катящемуся кругу и TG-FRET в один простой метод обнаружения нуклеиновых кислот может значительно расширить возможности диагностики и исследований рака на основе микроРНК.

Введение

Диагностика на основе микроРНК может сыграть ключевую роль в прогнозировании, диагностике, лечении и мониторинге заболеваний, поскольку в большинстве твердых (клетки и ткани) и жидких ( e.грамм. , кровь, моча, слюна) клинические образцы.1–5 Несмотря на быстрый рост исследований миРНК за последнее десятилетие и связь многих различных миРНК с различными патологиями, миРНК остается биомаркером следующего поколения и транслируется в рутинную клиническую практику. практика продвигается медленно. Хотя важность и потенциал miRNA-диагностики в значительной степени признаны, проблемы, связанные с, например, . , необходимо преодолеть различные уровни экспрессии в твердых и жидких биопсиях, технологические ограничения, отсутствие характерных для заболевания сигнатур микроРНК, стандартизацию рабочего процесса, а также свойства образцов и методы подготовки.1,2,4,5

Из стандартных методов обнаружения микроРНК, таких как количественная ПЦР с обратной транскрипцией (RT-qPCR), секвенирование следующего поколения (NGS) или микрочипы, RT-qPCR, возможно, является наиболее подходящей технологией для рутинного и простого использования.1,2 Однако , необходимость обратной транскрипции и нескольких праймеров (для RT и qPCR), чувствительность к загрязнению, вызванному экстракцией РНК, и довольно обширные рекомендации по получению надежных результатов с qPCR представляют собой серьезные недостатки для простого и надежного анализа.6 В подавляющем большинстве клинических исследований, в которых различные микроРНК в твердых (тканях) и жидких (кровь) биоптатах связывались с различными видами рака, инфекционными и сердечными заболеваниями, диабетом и сепсисом, использовались относительные концентрации, поскольку абсолютная количественная оценка невозможна с NGS и слишком неточны с RT-qPCR.3,5,7–14 Напротив, высокоселективный, чувствительный и точный абсолютный количественный анализ, обычно применяемый в иммуноанализах,15, вероятно, является одним из наиболее важных аспектов для успешного применения биомаркеров миРНК. в клинику.

Новые методы, которые могут преодолеть технические ограничения стандартных технологий,4,5,16 и в то же время обеспечивают необходимую чувствительность для количественного определения микроРНК в клинических образцах, имеют большой потенциал для значительного продвижения трансляционных исследований. В последние годы было разработано множество новых технологий, и наиболее часто применяемые стратегии включают обнаружение флуоресценции на основе наночастиц и амплификацию ДНК с оптическим или электрохимическим считыванием.17–23 Амплификация по катящемуся кругу (RCA) в сочетании с различными стратегиями считывания люминесценции может использоваться для специфического и чувствительного обнаружения миРНК. 17,24–27 тушитель Zhou et al. , 28 Ву и др. разработал анализ миРНК RCA-FRET с обнаружением в стационарном состоянии двух флуоресцентных красителей в виде пары FRET.26 Хотя это исследование для проверки концепции может обеспечить очень низкий предел обнаружения 103 аМ и надежное обнаружение выше фона 6 фМ, важные требования к отсутствовал применимый анализ микроРНК, такой как универсальность зонда, точность, воспроизводимость, сравнение со стандартной технологией и обнаружение эндогенных микроРНК в реальных клинических образцах.26 Из-за отсутствия доказательств для соответствующего клинического применения ни одна из новых технологий, основанных на флуоресценции, предложенных для простого обнаружения микроРНК, не была переведена в рутинную клиническую практику.

Чтобы продвинуть это трансляционное исследование, мы внедрили формат логометрического и одноэтапного обнаружения FRET с временным стробированием (TG-FRET)29,30 от донора Tb к акцептору Cy5.5 в целевом первичном RCA.31 Амплифицированный TG-FRET следует прямому рабочему процессу подготовки образцов (), а обнаружение TG-FRET () занимает всего несколько секунд на имеющемся в продаже клиническом иммунофлуоресцентном планшетном ридере (KRYPTOR).Применение лигазы SplintR позволило эффективно лигировать ДНК-зонд висячего замка над мишенью миРНК и, следовательно, могло обнаруживать миРНК в очень низких концентрациях без предварительной обратной транскрипции миРНК в кДНК. В отличие от многих других новых технологий, амплифицированный TG-FRET может не только обнаруживать очень небольшое количество миРНК, но также обеспечивает чрезвычайно высокую специфичность в отношении предшественников миРНК (пре-миРНК) и миРНК с однонуклеотидными вариациями. Мы демонстрируем немедленную практическую применимость путем точного количественного определения эндогенных миРНК из различных типов клинических образцов и для различных патологий, а именно миР-21 из плазмы и тканей человека, связанных с раком яичников и молочной железы32,33, а также миР-132 и миР-146a из . in vitro культивируемых клеток (THP-1), связанных с врожденными иммунными ответами.34 При низких концентрациях микроРНК, необходимых для клинической диагностики, амплифицированный TG-FRET обеспечивал как лучшую специфичность (различение однонуклеотидных вариаций в различных положениях внутри мишени), так и более высокую точность (меньшее распределение концентраций и лучшее различие между здоровыми и патологическими образцами). чем метод золотого стандарта RT-qPCR.

Принцип обнаружения микроРНК с помощью амплифицированного TG-FRET. (A) После специфического узнавания миРНК линейной ДНК висячего замка (1), разрыв ДНК висячего замка лигируют над шиной-мишенью миРНК с использованием лигазы SplintR (2), и миРНК становится праймером для полимеразы phi29 для синтеза и вытеснения (путем RCA) комплементарная ДНК вокруг кольцевой ДНК висячего замка (3).После остановки RCA продукт катящегося круга (RCP) инкубируют с донором Tb (Lumi4-Tb) и акцептором Cy5.5, мечеными оцДНК, которые гибридизуются со специфическими последовательностями, которые существуют более чем в 1000 раз на амплифицированном конкатемере RCP. Близкое расстояние Lumi4-Tb и Cy5.5 в RCP позволяет Tb-to-Cy5.5 FRET, что невозможно, если оба находятся в свободном состоянии в растворе (не гибридизованы с RCP). Таким образом, сигнал TG-FRET можно использовать для количественного определения микроРНК без каких-либо стадий промывки или разделения. (B) Ратиометрический TG-FRET, который измеряет соотношение FRET-сенсибилизированного Cy5.5 фотолюминесценции (ФЛ) и FRET-погашенной ФЛ Tb в течение определенного временного окна после импульсного возбуждения (для подавления аутофлуоресценции) используют для количественного определения миРНК-мишени в микролунке объемом 140 мкл в течение 5 секунд.

Результаты и обсуждение

Чувствительность и динамический диапазон

Для количественного определения микроРНК в технологии амплифицированного TG-FRET применяется синхронизированное по времени (0,1–0,9 мс после импульсного возбуждения) логометрическое определение интенсивности ФЛ (FRET-ratio) () Cy5. 5 акцепторов и доноров Lumi4-Tb (Tb) ( ср. ESI Fig. S1 для спектров поглощения/испускания и параметров FRET), что занимает всего несколько секунд на иммунофлуоресцентном считывателе планшетов KRYPTOR. Сначала мы оценили эффективность количественного определения миРНК на экзогенных миР-21, миР-132 и миР-146a. Лигазу SplintR использовали для эффективного лигирования ДНК-зондов висячих замков над мишенями микроРНК. Хотя было показано, что более короткие зонды с навесным замком демонстрируют более высокую интенсивность флуоресценции в RCA-FRET,26 мы выбрали зонды с навесным замком из 77 и 78 нуклеотидов (см. последовательности всех РНК и ДНК, использованных в исследовании).Эти относительно длинные ДНК позволили нам избежать перекрытия между последовательностями, которые распознавали мишени miRNA, и последовательностями, которые гибридизовали ДНК-зонды Tb-донора и красителя-акцептора, и оптимизировать расстояние FRET между Tb и красителем внутри продукта RCA. Фактическое расстояние Tb-краситель в продукте катящегося круга (RCP, ) составляло 18 пар оснований (см. комплементарные последовательности между висячим замком и зондами Tb и красителя). Это расстояние будет соответствовать ок. 7 нм при использовании 0,34 нм на пару оснований и 0.4 ± 0,1 нм как для Tb, так и для Cy5.5, и было показано, что оно отлично согласуется с измерениями FRET с временным разрешением на двухцепочечной (дц) ДНК.35 При сравнении распада ФЛ пары Tb-Cy5.5 FRET RCP и внутри двухцепочечной ДНК (ESI Fig. S2 ) среднее время жизни FRET-сенсибилизированных PL значительно короче для RCP-FRET-пары (0,4 мс против 2 мс), что означает, что средняя эффективность FRET выше (0,86 против 0,28). Это различие можно объяснить складчатой ​​(скрученной) структурой RCP и сопутствующим более близким расстоянием между донором и акцептором и/или взаимодействием одного донора с несколькими акцепторами, оба из которых приводят к более высокой эффективности FRET.Несмотря на различное поведение пары FRET Tb-краситель в свернутом конкатемере RCP, регулировка расстояния между донором и акцептором (различное количество пар оснований между Tb и красителем) все еще может использоваться для получения отчетливых распадов PL, которые применимы для обнаружения мультиплексированных нуклеиновых кислот. .31 Другой практической причиной неперекрывающихся последовательностей для мишеней микроРНК и флуоресцентных зондов была возможность использования одних и тех же зондов донора Tb и акцептора красителя для разных мишеней микроРНК (см. цветовой код на рис. ). Принимая во внимание множество различных микроРНК, связанных с различными видами рака,36,37 этот универсальный дизайн замка является важным преимуществом для диагностических приложений.

Таблица 1

Последовательности и модификации всех ДНК- и РНК-зондов и мишеней. Различия в последовательностях показаны красным цветом, сходство последовательностей показано пурпурным цветом, специфические концы ДНК висячего замка показаны синим цветом, последовательности, комплементарные Tb-зонду, показаны зеленым цветом, а последовательности, комплементарные зонду Cy5.5, показаны оранжевым цветом

Для всех трех мишеней микроРНК калибровочные кривые () показали увеличение значений отношения FRET с увеличением концентрации микроРНК.Пределы обнаружения (LOD) были определены (три стандартных отклонения от холостого образца) и составили 4,2 ± 0,5 аттомоля (30 ± 3 фМ) для миР-21, 6,8 ± 0,8 аттомоля (48 ± 5 фМ) для миР-132 и 14 ± 2 аттомолей (99 ± 10 фМ) для miR-146a (), а динамический диапазон концентраций охватывал более 3 порядков (от ~ 50 фМ до ~ 50 пМ).

(A) Калибровочные кривые для миР-21, миР-132 и миР-146a для концентраций от 0,05 до 1,0 пМ в 140 мкл растворов на микролунку. (B) Увеличенный вид тех же калибровочных кривых в диапазоне концентраций от 0 до 120 fM.LOD определяли, как показано (с использованием 3 стандартных отклонений бланка) до 30 ± 3 фМ для миР-21, 48 ± 5 фМ для миР-132 и 99 ± 10 фМ для миР-146a. ( C ) Калибровочная кривая анализа миР-21 в более широком диапазоне концентраций (до 50 пМ) для оценки динамического диапазона амплифицированных анализов TG-FRET.

Специфичность и сравнение с RT-qPCR

Другим важным требованием для диагностики является специфичность при очень низких концентрациях, что мы подтвердили, задав тест miR-21 различными количествами предшественника miR-21 (pre-miR-21) как а также три модифицированные мишени miR-21 с однонуклеотидными вариациями в разных положениях ().По сравнению с образцами без мишени pre-miR-21 не приводила к увеличению сигнала для TG-FRET (красная кривая на ), но значительно уменьшала количество циклов количественного определения ( C q ) для RT-qPCR (красная кривая на ), что приведет к завышению (положительному смещению) реальной целевой концентрации miR-21 (чем ниже C q , тем выше измеренная концентрация). Хотя значения C q для мишени miR-21 были намного ниже (черная кривая на ), неспецифический сигнал pre-miR-21 предполагает, что внутренняя последовательность miR-21 pre-miR-21 (с дополнительными 7 оснований на 5′-конце и 43 основания на 3′-конце) все еще могут быть подвергнуты обратной транскрипции и амплификации с помощью RT-qPCR, хотя и с гораздо меньшей эффективностью по сравнению с miR-21.Для TG-FRET весьма вероятно, что последовательность miR-21 внутри pre-miR-21 будет специфически гибридизоваться с ДНК висячего замка. Однако два выступающих конца 3′ и 5′ предотвращают амплификацию полимеразой phi29. Хотя было показано, что полимераза phi29 может обеспечивать экзонуклеолитическую активность 3′ → 5′ РНК, ее эффективность была примерно в 10 раз ниже, чем для ДНК.38 Поэтому мы предполагаем, что в наших экспериментальных условиях дополнительные 43 основания на 3′-конце не может гидролизоваться достаточно эффективно, чтобы инициировать RCA.Что касается однонуклеотидных вариаций миР-21, только миР-21 17 (U → A) в концентрациях выше 6 пМ приводила к значительному сигналу миР-21 для TG-FRET (зеленая кривая на). Этот неспецифический сигнал возникает из-за однонуклеотидной вариации в отдаленном положении от щели висячего замка на более длинном (12 нуклеотидов) распознающем мишень конце ДНК висячего замка (12). Универсальность конструкции навесного замка позволяет преодолеть даже такие особые несоответствия. Перемещение разрыва ближе к несоответствию и/или укорочение длины конца, распознающего несоответствие (10 нуклеотидов), полностью удаляло неспецифический сигнал, как показано двумя другими несовпадающими вариантами миР-21 (миР-21 10 (A → G) и miR-21 4 (C → U) – синие и пурпурные кривые на рис.Напротив, на золотой стандарт RT-qPCR сильно повлияли все три несовпадающих миР-21 (). Хотя циклы количественного определения ( C q ) отличались от исходной мишени miR-21, они значительно уменьшились до значений, намного ниже тех, которые наблюдались без какой-либо мишени. Хотя такие несоответствия приведут к положительному смещению реальной целевой концентрации miR-21, этап RT RT-qPCR может привести к отрицательному смещению концентрации. Наличие внутренних или терминальных последовательностей РНК, комплементарных очень короткой гибридизационной последовательности (от 6 до 8 нуклеотидов) праймера «стебель-петля» ОТ, может распознаваться праймером ОТ и, следовательно, снижать эффективность ОТ и продуцировать меньше кДНК.В самом деле, как внутренние, так и терминальные комплементарные последовательности иначе неродственных РНК приводили к значительному снижению измеренных концентраций miR-21 (10). Такие короткие последовательности, комплементарные праймеру «стебель-петля» ОТ, могут существовать во многих различных РНК, присутствующих в реальных клинических образцах, и представляют собой серьезный недостаток для диагностики на основе ОТ-КПЦР. Эти результаты ясно показывают еще одно важное преимущество усиленного TG-FRET, когда речь идет о клинических применениях.

(A) Специфичность амплифицированного TG-FRET и TaqMan RT-qPCR для миР-21 (черный) была проверена против пре-миР-21 (красный) и трех разных мишеней с однонуклеотидными вариациями по сравнению с миР-21 ( синий, зеленый и пурпурный).(B) Для амплифицированного TG-FRET только несовпадение в отдаленном положении от щели висячего замка на более длинном (12 нуклеотидов) конце, распознающем мишень, приводило к неспецифическому сигналу при повышенных концентрациях миРНК (миР-21 17 (U → А), зеленая кривая). Универсальная конструкция зонда может решить эту проблему за счет использования зонда с навесным замком с зазубриной ближе к несоответствию (miR-21 10 (A → G), синяя кривая) или с более коротким концом распознавания цели (10 нт) над несоответствие (miR-21 4 (C → U), пурпурная кривая).Pre-miR-21 (красная кривая) также не приводила к какому-либо неспецифическому сигналу. Черная кривая показывает сигнал для мишени miR-21 (без каких-либо расхождений). (C) TaqMan RT-qPCR находится под сильным влиянием pre-miR-21 (красная кривая) и всех трех однонуклеотидных вариаций (синяя, зеленая и пурпурная кривая), как показано уменьшением количества циклов количественного определения ( C q ) с увеличением концентраций несоответствия (в том же диапазоне низких пикомолярных концентраций миРНК, что и для TG-FRET – , см. график на B).Серая пунктирная линия указывает значение C q для образцов без мишени. (D) Короткая последовательность целевой гибридизации праймера TaqMan RT-stem loop может привести к обратной транскрипции РНК, которая имеет ту же внутреннюю или концевую последовательность, что и целевой конец. (E) Как внутренние, так и терминальные интерферирующие последовательности приводили к отрицательным смещениям (до 40% для РНК int (терминал)) целевой концентрации ([миР-21] = 10 пМ).

Обнаружение миРНК в плазме, тканях и клетках человека больных раком яичников и 13 образцов здоровых людей), hsa-miR-21 в 10 образцах тканей, связанных с раком молочной железы (4 здоровых ткани и 6 первичных опухолевых тканей), и hsa-miR-132 и hsa-miR-146a в образцах лизата от 0.25 × 10

6 и 3 × 10 6 клеток THP-1, стимулированных липополисахаридом (ЛПС) в течение 0 ч или 24 ч. Для сравнения все образцы также были количественно определены с помощью TaqMan RT-qPCR.

Образцы плазмы, возможно, являются наиболее сложными для диагностики на основе миРНК из-за низких концентраций миРНК и больших вариаций экспрессии миРНК. Как показано на рисунке, амплифицированные значения TG-FRET обеспечивают гораздо более узкое распределение концентраций по сравнению с RT-qPCR. При применении порогового значения (максимальная концентрация в здоровых образцах без выбросов) TG-FRET может выявить значительную разницу между здоровыми образцами и образцами рака яичников (62% выше и 38% ниже пороговой линии), тогда как RT-qPCR показала лишь незначительные различия ( 17% выше и 83% ниже пороговой линии).Сравнение всех образцов на диаграмме рассеяния (концентрации TG-FRET и RT-qPCR, ) показало разницу между обоими методами. Хотя образцы были распределены ниже и выше идеальной линии 1 : 1, стала очевидной тенденция к более высоким концентрациям RT-qPCR ( около 3 : 1). Диаграмма рассеяния также показала большое распределение концентрации как здоровых, так и раковых образцов и лучшее различие раковых и здоровых образцов для TG-FRET. Кривые рабочих характеристик приемника (ROC) (рис.S4 ) показали, что как TG-FRET, так и RT-qPCR обеспечивают лучшую диагностическую эффективность, чем случайное предположение, но что TG-FRET может значительно лучше классифицировать здоровые и раковые образцы. Хотя результаты показали лучшую аналитическую производительность TG-FRET, они также подтвердили проблемы количественного определения миРНК в плазме и то, что для получения четкого клинического заключения необходимы более крупные когорты образцов. 39 Тем не менее, результаты этого исследования на 26 различных образцах плазмы ясно показали, что амплифицированный TG-FRET обладает большим потенциалом для добавления значительных преимуществ в клинические исследования с большими когортами пациентов.

(A) Абсолютное количественное определение hsa-miR-21 в плазме человека (рак яичников) с использованием амплифицированного TG-FRET (синий) и RT-qPCR (красный). Количественно определяли концентрации миР-21 (в экстрактах малых РНК) в 13 здоровых контрольных образцах и 13 образцах рака яичников. Кружки вокруг точек данных указывают на статистические выбросы (зеленым цветом отмечен только один из методов, черным — оба метода). Усы представляют максимальное и минимальное значения (без выбросов), а горизонтальные линии представляют медиану. Пунктирные линии представляют собой пороговое значение (максимум здоровых контрольных образцов).Дополнительную информацию об образцах и участниках исследований на людях можно найти в таблицах ESI S1 и S2. Все концентрации приведены в числе копий на нг малой РНК. Абсолютные (молярные) концентрации показаны на рис. S3 ESI. (B) Диаграмма рассеяния, сравнивающая концентрации RT-qPCR и TG-FRET для тех же образцов. Здоровые образцы показаны черным цветом, а образцы рака — пурпурным. Для ориентации показаны линии идеального соответствия (1 : 1) между двумя методами и в 3 раза более высокие значения RT-qPCR (3 : 1).Кружки вокруг точек данных указывают на статистические выбросы из (A). Синие и красные пунктирные линии представляют пороговые значения из (A).

Более узкое распределение определяемых TG-FRET концентраций также было обнаружено для тканей рака молочной железы (). Хотя мы располагали меньшим количеством образцов по сравнению с плазмой, различие между здоровыми и раковыми образцами было очевидным. Одной из причин могут быть более высокие абсолютные концентрации (пМ в плазме и нМ в ткани – ср. ESI рис. S3a и b ), поскольку известно, что RT-qPCR менее точна при низком вводе мишени.16 Как амплифицированный TG-FRET, так и RT-qPCR могли очень хорошо различать здоровые и раковые ткани (100% здоровых образцов ниже порогового значения и 100% образцов рака выше порогового значения). Подобно результатам в плазме, значения концентрации miR-21 для RT-qPCR были значительно выше (также примерно в 3 раза) по сравнению с TG-FRET, но при сравнении обоих методов распределение на диаграмме рассеяния было намного меньше (). Хотя когорта пациентов была относительно небольшой, результаты ясно показывают, что амплифицированный TG-FRET может предоставить очень полезную клиническую информацию (здоровье или рак) при относительно простом рабочем процессе без обратной транскрипции и без помех от реагентов, используемых для выделения РНК.Таким образом, TG-FRET можно использовать как самостоятельный или дополнительный аналитический метод для достижения более высокой точности диагностики тканей на основе микроРНК.

(A) Абсолютное количественное определение hsa-miR-21 в ткани человека (рак молочной железы) с использованием амплифицированного TG-FRET (синий) и RT-qPCR (красный). Количественно определяли концентрации миР-21 (в экстрактах тотальной РНК) четырех здоровых тканей (неопухолевая грудь) и шести тканей опухоли молочной железы. Круг вокруг точки данных указывает на статистический выброс. Усы представляют максимальное и минимальное значения (без выбросов), а горизонтальные линии представляют медиану.Пунктирные линии представляют собой пороговое значение (максимум здоровых контрольных образцов). Дополнительную информацию об образцах и участниках исследований на людях можно найти в таблицах ESI S1 и S2. Все концентрации даны в количестве копий на нг общей РНК. Абсолютные (молярные) концентрации показаны на рис. S3 ESI. (B) Диаграмма рассеяния, сравнивающая концентрации RT-qPCR и TG-FRET для тех же образцов. Здоровые образцы показаны черным цветом, а образцы рака — пурпурным. Для ориентации показаны линии идеального соответствия (1 : 1) между двумя методами и в 3 раза более высокие значения RT-qPCR (3 : 1).Круг вокруг точки данных указывает на статистический выброс из (A). Синие и красные пунктирные линии представляют пороговые значения из (A).

Чтобы продемонстрировать успешное применение амплифицированного TG-FRET помимо диагностики рака и для третьего типа образцов, было проведено количественное определение двух других эндогенных миРНК (hsa-miR-132 и hsa-miR-146a) в экстрактах общей РНК из LPS- стимулированные клетки THP-1 (). Стимуляция LPS приводила к значительному увеличению концентрации миР-132 как для меньшего (250 000 клеток), так и для большего (3 × 10 6 клеток) количества клеток.Большее количество клеток позволило нам произвести больше тотальной РНК, но примерно в равных концентрациях ( ср. Таблица ESI S1 ). Подобно измерениям в плазме и тканях, значения концентрации были (2,4 ± 1,1) раза выше для RT-qPCR по сравнению с TG-FRET. Эти более высокие значения концентрации во всех трех типах клинических образцов предполагают, что положительное смещение концентрации RT-qPCR ( ср. ), вызванное miR с очень похожими последовательностями, значительно сильнее, чем отрицательное смещение концентрации ( ср.), вызванный стадией RT RT-qPCR. Абсолютные концентрации ( ср. ESI Fig. S3 ) были аналогичны образцам плазмы (диапазон концентраций pM). Среднее относительное увеличение из-за стимуляции LPS было 5,3/22-кратным и 3,5/7,8-кратным (меньшее/большее количество клеток) для TG-FRET и RT-qPCR соответственно. Большее количество клеток использовали для количественного определения miR-146a. Значения концентрации были в 14 раз ниже (без стимуляции) и в 1,5 раза выше (24-часовая стимуляция) для RT-qPCR, и на этот раз относительное увеличение из-за стимуляции LPS было 18-кратным и 395-кратным для TG-FRET и RT. -qPCR, соответственно.TG-FRET продемонстрировал лучшее согласие с предыдущим исследованием, в котором сообщалось, что и миР-132, и миР-146а показали эквивалентное повышение, а уровень миР-146а был примерно в 8 раз (нормализован до 5S РНК)34. Опять же, мы использовали всего несколько образцов для демонстрации количественного определения микроРНК в клетках, и хотя результаты были более последовательными для TG-FRET, для подтверждения его лучшей производительности потребуется более масштабное исследование. Однако, как и в случае с образцами тканей, мы смогли четко показать (и подтвердить с помощью RT-qPCR), что TG-FRET может эффективно отличать LPS-стимулированные клетки от нестимулированных и что эта новая технология может стать полезным инструментом для клеточного анализа. диагностика на основе микроРНК.

Абсолютное количественное определение hsa-miR-132 и hsa-miR-146a в культивируемых клетках in vitro (стимуляция LPS) с использованием амплифицированного TG-FRET (синий) и RT-qPCR (красный). Концентрации miR-132 (слева) и miR-146a (справа) (в экстрактах общей РНК) клеток THP-1 после 0 ч и 24 ч стимуляции LPS (1 мкг мл –1 ). Примечание: значение miR-146a для 0-часовой стимуляции, измеренное с помощью RT-qPCR, составляет 0,9 и, следовательно, не видно в шкале концентраций. Более подробную информацию об образцах можно найти в таблице ESI S1. Все концентрации даны в количестве копий на нг общей РНК. Абсолютные (молярные) концентрации показаны на рис. S3 ESI.

Выводы

Важность микроРНК в биологической регуляции, функции клеток, развитии и прогрессировании рака и других заболеваний3,7,9,12,13 в сочетании со сложными биологическими и аналитическими условиями4,5,16 привело к появлению многих технологий обнаружения микроРНК, каждая из которых имеет определенные преимущества и недостатки.1,39–46 Крайне важными требованиями к новой технологии, которая должна стать полезным дополнительным методом обнаружения миРНК и способствовать развитию диагностики и трансляционных исследований на основе миРНК, являются не только чувствительность и специфичность, но и способность применяться к различным типам клинических образцов и для получения полезной клинической информации из этих образцов.

В нашем исследовании мы представили разработку, характеристику и применение новой амплифицированной технологии TG-FRET для абсолютного количественного определения микроРНК.Амплифицированный TG-FRET использует простой изотермический RCA и ратиометрический анализ TG-FRET для точного количественного определения на коммерческом ридере для клинических планшетов (KRYPTOR). Быстрый анализ микроРНК не требует каких-либо этапов разделения или промывки и может непосредственно определять количество микроРНК без обратной транскрипции в кДНК. Чтобы выполнить технологические и клинические требования, мы разработали TG-FRET для высокой чувствительности, специфичности и использования для количественного определения микроРНК из плазмы, тканей и клеток человека. Тщательная характеристика чувствительности и специфичности миР-21, миР-132 и миР-146a выявила LOD до 4.2 аттомолей (30 фМ), эффективное различение однонуклеотидных вариаций и предшественников микроРНК, а также значительные преимущества в специфичности по сравнению с RT-qPCR.

Чтобы оценить непосредственную применимость к широкому кругу биологических или клинических исследований, мы протестировали эффективность анализа на небольших группах различных типов образцов (плазма, ткань и клетки) с разным патологическим фоном (рак яичников, рак молочной железы и врожденный иммунный ответ) в сравнении один к одному с TaqMan RT-qPCR.В то время как количественная оценка hsa-miR-21 в ткани позволила провести четкое различие между здоровой и опухолевой тканью, а количественная оценка hsa-miR-132 и hsa-miR-146a в клетках THP-1 предоставила четкие доказательства наличия LPS-стимулированных или нестимулированных клеток, патологическая оценка образцов плазмы оказалась более сложной. С диагностической точки зрения TG-FRET явно превосходит RT-qPCR: 62% образцов раковой плазмы обнаруживаются выше максимального значения концентрации здоровых контрольных образцов, тогда как RT-qPCR обнаруживает только 17% выше порогового значения.Для большинства образцов (независимо от типа образца) RT-qPCR выявила более высокие концентрации (примерно в 3 раза), чем TG-FRET и RT-qPCR, определенные концентрации со значительно большим распределением. Мы связываем эти более высокие и более широкие значения RT-qPCR с проблемами специфичности ( сравните с ), восприимчивостью к помехам с реагентами для экстракции образцов и более низкой точностью этого метода экспоненциальной амплификации при низком целевом вводе. Возможность количественного определения различных микроРНК из различных типов клинически значимых образцов, получение значительной патологической информации из этих измерений, преимущества в простоте и точности по сравнению с RT-qPCR, а также адаптируемость изотермической процедуры без промывки к живым клеткам. визуализации, сделает TG-FRET очень полезным инструментом (в сочетании с другими технологиями или как отдельный метод) для продвижения диагностики и исследований на основе микроРНК.Более того, амплифицированный TG-FRET может оказать существенное влияние на трансляцию биомаркеров миРНК в клинику.

Материалы и методы

Зонды нуклеиновых кислот и экзогенные мишени

Все последовательности и модификации нуклеиновых кислот обобщены в . Все олигонуклеотиды были приобретены у Eurogentec. Фосфатные ДНК очищали электрофорезом в полиакриламидном геле. Все остальные модифицированные ДНК и РНК очищали с помощью ВЭЖХ. Lumi4-Tb-NHS (Tb-NHS) был предоставлен Lumiphore, Inc.Конъюгацию Tb-ДНК проводили, как описано в другом месте.18 Вкратце, конъюгаты Tb-ДНК получали путем смешивания Tb-NHS в избыточной концентрации с аминофункционализированными олигонуклеотидами в 100 мМ карбонатного буфера при pH 9,0. Смеси инкубировали в течение ночи при 4°С. Конъюгаты Tb-ДНК очищали 3 раза с помощью буфера HEPES (100 мМ, pH 7,4) с помощью колонок Zeba Spin Desalting Columns (MWCO 7 кДа). Концентрации Tb определяли путем измерения поглощения при 340 нм с использованием молярной абсорбции 26 000 M –1 см –1 , как указано производителем.ДНК количественно определяли путем измерения поглощения при 260 нм. Коэффициенты конъюгации определяли линейной комбинацией соответствующих значений поглощения Tb и олиго в конъюгатах Tb-олиго и во всех случаях превышали 0,9 Tb/ДНК.

Фотофизический анализ

Спектры поглощения (система Lambda 35 UV/Vis, PerkinElmer) и спектры испускания (FluoTime 300, PicoQuant) записывали в буфере HEPES (100 мМ, pH 7,4) и деионизированной воде (очищенной с помощью Purelab Option-Q, оборудованной с биофильтром, ELGA LabWater) для Tb и Cy5.5 образцов соответственно.

Амплифицированные анализы микроРНК TG-FRET

анализа микроРНК были подготовлены на чистом стенде. В типичном анализе 1,5 нМ зонд висячего замка и соответствующее количество миРНК-мишени готовили в 10 мкл оптимизированного реакционного буфера ДНК-лигазы SplintR (BUFFER-1, 50 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgCl 2 , 100 мМ NaCl, 10 мкМ АТФ, 10 мМ ДТТ, рН 7,6), и смесь инкубировали в термоциклере с программой контроля температуры (80 °С в течение 2 мин → снижение с 80 °С до 22 °С при 2 °С мин. –1 скорость).Затем к смеси добавляли 21,5 ЕД ДНК-лигазы SplintR (New England Biolabs), приготовленной в 5 мкл BUFFER-1, и инкубировали при 37 °C в течение 1 часа. Затем 15 мкл phi29 ДНК-полимеразного реакционного буфера (BUFFER-2, 1× компоненты буфера: 50 мМ Tris-Cl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ (NH 4 ) 2 SO 4 , 4 мМ DTT, pH 7.4), который содержал 5 ед. ДНК-полимеразы phi29 (New England Biolabs) и 0,5 мМ dNTP (New England Biolabs), добавляли и инкубировали при 37 °C в течение 3 часов. До окончания процесса полимеризации 2.Добавляли 5 нМ зонда Tb и 2,5 нМ зонда Cy5.5, приготовленные в 120 мкл гибридизационного буфера (БУФЕР-3, 20 мМ Трис-Cl, 500 мМ NaCl, 0,1% БСА, рН 8,0), а затем инкубировали в термоциклере с программа контроля температуры (65 °C в течение 10 мин → снижение с 65 °C до 22 °C со скоростью 2 °C min –1 → 22 °C в течение 10 мин). Из общего реакционного объема 150 мкл 140 мкл отмеряли в черных 96-луночных титрационных микропланшетах на клиническом иммунофлуоресцентном ридере KRYPTOR compact plus (Thermo Fisher Scientific) с временным затвором (0.1–0,9 мс) детектирование интенсивности ФЛ с помощью оптических полосовых фильтров (Semrock) с 494 ± 12 нм для канала детектирования Tb и 716 ± 20 нм для канала детектирования Cy5.5. Для логометрического анализа коэффициенты FRET рассчитывали по соотношению интенсивностей ФЛ Cy5.5 и Tb с временным стробированием.

Экстракция РНК

Тканевой материал был получен с информированного согласия в Медицинском университете Граца и больнице Св. Иоанна Божия Граца при одобрении комитета по этике Медицинского университета Граца и комитета по этике Медицинского университета Св.Больница Иоанна Божия в Граце (23-015 ex 10/11). Все образцы тканей молочной железы были собраны в ходе рутинных вмешательств и вскрытий соответственно и использовались анонимно/псевдонимизированно. Использование было одобрено ответственным комитетом по этике. Все образцы плазмы были собраны у анонимных пациентов с письменного информированного согласия в соответствии с соглашением ответственных этических комитетов (официальное разрешение n ° 2746 «comité de protection des personnes Ile de France III» — 5 января 2010 г.).Для всех образцов плазмы для выделения малой РНК использовали набор miRCURY™ RNA Isolation Kit-Biofluids (Exiqon). Экстракцию проводили в соответствии с инструкциями производителя. В типичном эксперименте 250 мкл каждого образца плазмы центрифугировали при 3000 g в течение 5 минут для осаждения дебриса и нерастворимых компонентов после оттаивания. 200 мкл супернатанта переносили в новую пробирку и добавляли в раствор 60 мкл лизирующего раствора и 1,2 мкл РНК MS2 (Sigma-Aldrich) на 3 мин при комнатной температуре для лизиса компонентов плазмы.После этого добавляли 20 мкл раствора белкового осадка на 1 мин при комнатной температуре. Осажденную смесь центрифугировали в течение 3 мин при 11 000 g и прозрачный супернатант переносили в новую пробирку для сбора. Затем к собранному супернатанту добавляли 270 мкл изопропанола и раствор загружали в микроРНК-мини-спин-колонку на 2 мин при комнатной температуре. После центрифугирования в течение 30 с при 11 000 g раствор однократно промывали 100 мкл промывочного раствора 1 и дважды промывочным раствором 2 (700 мкл и 250 мкл).Наконец, РНК элюировали 50 мкл воды, свободной от РНКазы, и все выделения РНК хранили при –80 °C. Суммарную РНК выделяли из быстрозамороженных образцов ткани молочной железы человека с использованием реагента Trizol (Life Technologies) с последующей экстракцией фенол-хлороформом. Клетки THP-1 выращивали в среде RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки, 1% пенициллина/стрептомицина и L-глутамина. Клетки THP-1 не обрабатывали (0 ч) или обрабатывали в течение 24 ч (24 ч) ЛПС (1 мкг мл –1 ). Суммарные РНК экстрагировали с использованием набора miRNeasy Mini Kit с Qiacube (QIAGEN) в соответствии с инструкциями производителя.Концентрацию РНК определяли с помощью спектрофотометра NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, Waltham, США). Общие концентрации РНК и доступные объемы всех образцов приведены в таблице ESI S1.

Абсолютное количественное определение миРНК с помощью амплифицированного TG-FRET

Абсолютные концентрации неизвестных миРНК определяли с помощью калибровочной кривой (отношение FRET к концентрации), построенной с использованием синтетических миРНК с известными концентрациями (от 0,05 до 1). .0 пМ в 140 мкл растворов). Неизвестные миРНК разбавляли при различных коэффициентах разведения, чтобы убедиться, что диапазон их концентраций соответствует одной из калибровочных кривых.

Анализ микроРНК для RT-qPCR

Наборы для анализа микроРНК TaqMan (Thermo Fisher) использовались во всех экспериментах с RT-qPCR. Все экстракты РНК плазмы разводили в пять раз. Экстракты РНК ткани рака молочной железы разбавляли до 0,5 нг мкл –1 общей РНК, за исключением образцов опухоли молочной железы 3, 4 и 6 (таблица ESI S1 ), которые были разбавлены до 0.25 нг мкл –1 суммарных РНК. Все остальные экстракты РНК разбавляли до 2 нг мкл –1 общей РНК. Реакции ОТ проводили с использованием набора TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Thermo Fisher) в 15 мкл, содержащего 5 мкл экстракта РНК, 0,15 мкл 100 мМ dNTP, 1 мкл Multiscribe обратной транскриптазы (50 ед. мкл –1 ), 1,5 мкл 10-кратного буфера для обратной транскрипции, 0,19 мкл ингибитора РНКазы (20 ед. мкл –1 ), 3 мкл геноспецифического праймера и 4,16 мкл воды без нуклеазы.Для синтеза кДНК реакционные смеси инкубировали при 16°С 30 мин, при 42°С 30 мин, при 85°С 5 мин, затем выдерживали при 4°С. Затем 1,33 мкл раствора кДНК амплифицировали с использованием 10 мкл TaqMan Universal PCR Master Mix II с UNG (Thermo Fisher), 1 мкл геноспецифического праймера и зонда и 7,67 мкл воды без нуклеаз в конечном объеме 20 мкл. мкл. Количественную ПЦР проводили на системе ПЦР в реальном времени PikoReal (Thermo Fisher Scientific), реакционные смеси инкубировали при 95°C в течение 10 мин, затем проводили 40 циклов при 95°C в течение 15 с и при 60°C в течение 1 мин. .Количественные циклы ( C q ) рассчитывали с помощью программного обеспечения PikoReal (Thermo Scientific). Абсолютные концентрации неизвестных миРНК определяли с помощью калибровочной кривой ( C q превышения концентрации), построенной с использованием синтетических миРНК с известными концентрациями.

Статистический анализ.

TG-FRET. которые готовили 10 раз и измеряли в трех экземплярах (
n = 30).Для тестов на специфичность все образцы готовили и измеряли один раз. Для обнаружения реальных образцов все образцы готовили в двух экземплярах и измеряли один раз ( n = 2). Все измерения RT-qPCR были выполнены в двух повторностях и измерены один раз ( n = 2).

Доступность данных

Все исходные данные амплифицированных измерений TG-FRET и RT-qPCR, а также все другие соответствующие данные можно получить у соответствующего автора по запросу.

Конфликт интересов

Авторы заявляют о конфликте финансовых интересов: Н.H. и X.Q. названы изобретателями предварительной заявки на европейский патент под номером EP16305582.

Финансирование

Работа выполнена при поддержке Европейской комиссии (проект Инициативы инновационной медицины «OncoTrack» и h3020-FET-Open, проект PROSEQO), Французского национального исследовательского агентства (проекты Investissements d’Avenir «Labex NanoSaclay: ANR-10- LABX-0035» и «IDEX Paris-Saclay» и проект ANR «AMPLIFY»), Университетский институт Франции (IUF), Китайский стипендиальный совет (CSC), французский «Institut National Du Cancer» и «Direction générale de l «offre de soins» (INCa и DGOS; проект PRTk 16158 – Gynomir), французский «Institut National de la santé et de la recherche médicale» (INSERM) и Университет Монпелье.

Вклад авторов

X. Q. спланировал исследования, провел подготовку образцов и эксперименты, проанализировал данные и написал рукопись. JX и JG выполнили подготовку образцов, эксперименты RCA-FRET, эксперименты RT-qPCR и проанализировали данные. А. Я.-А. провели эксперименты RT-qPCR. Н.К. и П.Б. подготовили образцы плазмы и установили экспериментальные условия для оптимального обнаружения миР-21 в этих образцах. C. R. и MD предоставили средство RT-qPCR и руководство по его использованию и интерпретации.C.U. и S.G. отобрали пациенток-доноров карциномы яичников и получили их информированное согласие. И. Д.-Р. и Ф. А. подготовили клетки и образцы THP-1, разработали эксперименты THP-1 и проанализировали данные. J. J. U. провел подготовку образца ткани молочной железы. Н. Г.-С. повторно оценили все использованные опухолевые ткани и собранные образцы тканей. Дж. Х. диагностировал и переоценил все использованные опухолевые ткани и собранные образцы тканей. Н. Х. задумал и руководил проектом, проанализировал данные и написал рукопись.Все авторы внесли свой вклад в редактирование и написание рукописи и утвердили ее окончательный вариант.

Дополнительный материал

Дополнительная информация

Благодарности

Мы благодарим Lumiphore, Inc. за предоставленные реагенты Lumi4® и выражаем признательность Андреасу Пунчарту из Медицинского университета Граца за плодотворные обсуждения.

Ссылки

  • Густафсон Д., Тырышкин К., Ренвик Н. Best Pract. рез., клин. Эндокринол. Метаб. 2016; 30: 563–575.[PubMed] [Google Scholar]
  • Каппель А., Келлер А. Клин. хим. лаборатория Мед. 2016; 55: 636–647. [PubMed] [Google Scholar]
  • Верма П., Пандей Р. К., Праджапати П., Праджапати В. К. Фронт. микробиол. 2016;7:1274. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Witwer KW Clin. хим. 2015;61:56–63. [PubMed] [Google Scholar]
  • Чжан Дж. Э. Биохимик. 2016; 38:26–29. [Google Scholar]
  • Бастин С. А., Бенеш В., Гарсон Дж. А., Хеллеманс Дж., Хаггет Дж., Кубиста М., Mueller R., Nolan T., Pfaffl M.W., Shipley G.L., Vandesompele J., Wittwer C.T. Clin. хим. 2009; 55: 611–622. [PubMed] [Google Scholar]
  • Ха М., Ким В. Н. Нат. Преподобный Мол. Клеточная биол. 2014;15:509–524. [PubMed] [Google Scholar]
  • Кобольдт Д. К., Фултон Р. С., Маклеллан М. Д., Шмидт Х., Калики-Вейзер Дж., МакМайкл Дж. Ф., Фултон Л. Л., Дулинг Д. Дж., Динг Л., Мардис Э. Р. Природа. 2012; 490:61–70. [Google Scholar]
  • Лу Дж., Гетц Г., Миска Э. А., Альварес-Сааведра Э., Лэмб Дж., Пек Д., Свит-Кордеро А., Эбет Б.Л., Мак Р.Х., Феррандо А.А., Даунинг Дж.Р., Джекс Т., Хорвиц Х.Р., Голуб Т.Р. Природа. 2005; 435:834–838. [PubMed] [Google Scholar]
  • Луджамбио А., Лоу С. В. Природа. 2012; 482:347–355. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Музный Д. М., Бейнбридж М. Н., Чанг К., Динь Х. Х., Драммонд Дж. А., Фаулер Г., Ковар С. Л., Льюис Л. Р., Морган М. Б., Ньюшем И. Ф. Природа. 2012; 487:330–337. [Google Scholar]
  • Пенчева Н., Тавазоиэ С.Ф. Нац. Клеточная биол. 2013; 15: 546–554. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Шварценбах Х. и Пантель К., МикроРНК в медицине, John Wiley & Sons, Hoboken, NJ, 2014, стр. 567–588. [Google Scholar]
  • Weiland M., Gao X. H., Zhou L., Mi Q. S. RNA Biol. 2012; 9: 850–859. [PubMed] [Академия Google]
  • Wild D., The Immunoassay Handbook, Elsevier, London, 4th edn, 2013. [Google Scholar]
  • Mestdagh P., Hartmann N., Baeriswy L., Andreasen D., Bernard N., Chen C., Cheo D., D’Andrade P., DeMayo M., Dennis L. Nat. Методы. 2014; 11:809–815. [PubMed] [Google Scholar]
  • Hong C., Baek A., Hah S.S., Jung W., Kim D.E. Anal. хим. 2016;88:2999–3003. [PubMed] [Google Scholar]
  • Qiu X., Hildebrandt N. ACS Nano. 2015;9:8449–8457. [PubMed] [Google Scholar]
  • Zhao Y. X., Chen F., Li Q., ​​Wang L. H., Fan C. H. Chem. 2015; 115:12491–12545. [PubMed] [Google Scholar]
  • Shah P., Choi S.W., Kim H.J., Cho S.K., Bhang Y.J., Ryu M.Y., Thulstrup P.W., Bjerrum M.J., Yang S.W. Nucleic Acids Res. 2016;44:e57. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Xu F., Dong H.F., Cao Y., Lu H.T., Meng X.D., Dai WH, Zhang X.J., Al-Ghanim K.A., Mahboob S. ACS Appl. Матер. Интерфейсы. 2016;8:33499–33505. [PubMed] [Google Scholar]
  • Cheng Y. Q., Zhang X., Li Z. P., Jiao X. X., Wang Y. C., Zhang Y. L. Angew. хим., межд. Эд. 2009;48:3268–3272. [PubMed] [Google Scholar]
  • Чжоу Ю. Т., Хуан Ц., Gao J.M., Lu J.X., Shen X.Z., Fan C.H. Nucleic Acids Res. 2010;38:e156. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Chen A., Ma S., Zhuo Y., Chai Y., Yuan R. Anal. хим. 2016;88:3203–3210. [PubMed] [Google Scholar]
  • Jiang H. X., Liang Z. Z., Ma Y. H., Kong DM, Hong Z. Y. Anal. Чим. Акта. 2016; 943:114–122. [PubMed] [Google Scholar]
  • Wu X., Zhu S., Huang P., Chen Y. Anal. Биохим. 2016; 502:16–23. [PubMed] [Google Scholar]
  • Zhang X., Liu H., Li R., Zhang N., Xiong Y., Niu S., Shinsuke S., Atsushi N., Kenji A., Yasuhiro A. Chem. коммун. 2015;51:6952–6955. [Google Scholar]
  • Zhou F.L., Li B.X., Ma J.Y. RSC Adv. 2015;5:4019–4025. [Академия Google]
  • Цвир Дж. и Хильдебрандт Н., в Reviews in Fluorescence 2016, изд. CD Geddes, Springer International, 2017. [Google Scholar]
  • Hildebrandt N., Wegner K.D., Algar W.R. Coord. хим. 2014; 273:125–138. [Google Scholar]
  • Qiu X., Guo J., Xu J., Hildebrandt N.J. Phys. хим. лат. 2018;9:4379–4384. [PubMed] [Google Scholar]
  • Chan J. K., Blansit K., Kiet T., Sherman A., Wong G., Earle C., Bourguignon L. Y. W. Gynecol. Онкол. 2014; 132:739–744. [PubMed] [Google Scholar]
  • Zhang CF, Liu K., Li T., Fang J., Ding YL, Sun LX, Tu T., Jiang XY, Du SM, Hu JB, Zhu W., Chen HB, Sun XC Int. Дж. Онкол. 2016;48:161–172. [PubMed] [Google Scholar]
  • Таганов К. Д., Болдин М. П., Чанг К. Дж., Балтимор Д.проц. Натл. акад. науч. США 2006; 103:12481–12486. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Qiu X., Guo J. J., Jin Z. W., Petreto A., Medintz I. L., Hildebrandt N. Small. 2017;13:1700332. [Академия Google]
  • База данных miRCancer, http://mircancer.ecu.edu, по состоянию на 08.15.2017, 2017.
  • Xie B.Y., Ding Q., Han HJ, Wu D. Биоинформатика. 2013; 29: 638–644. [PubMed] [Google Scholar]
  • Лагунавичюс А., Киверите З., Зимбайте-Рускулене В., Радзвилавичюс Т., Янулайтис А. РНА. 2008; 14: 503–513. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Graybill RM, Bailey RC Anal. хим. 2016; 88: 431–450. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Jin Z. W., Geissler D., Qiu X., Wegner K. D., Hildebrandt N. Angew. хим., межд. Эд. 2015;54:10024–10029. [PubMed] [Google Scholar]
  • Deng R.J., Zhang K.X., Li J.H. Acc. хим. Рез. 2017;50:1059–1068. [PubMed] [Google Scholar]
  • Джонсон Б. Н., Мутарасан Р. Аналитик.2014; 139:1576–1588. [PubMed] [Google Scholar]
  • Chen H. L., Guo M. M., Tang H., Wu Z., Tang L. J., Yu R. Q., Jiang J. H. Anal. Методы. 2015;7:2258–2263. [Google Scholar]
  • Shen Y.T., Tian F., Chen Z.Z., Li R., Ge Q.Y., Lu Z.H. Biosens. Биоэлектрон. 2015;71:322–331. [PubMed] [Google Scholar]
  • Kilic T., Erdem A., Ozsoz M., Carrara S. Biosens. Биоэлектрон. 2018; 99: 525–546. [PubMed] [Google Scholar]
  • Chen Y. X., Huang K. J., Niu K. X. Biosens. Биоэлектрон.2018; 99: 612–624. [PubMed] [Google Scholar]

Воспроизведение: Финальный акт Маргарет Мозер: трибьют-концерт Маргарет Мозер, получение денег от Black Fret и последний шанс номинировать местных жителей в музыкальном опросе Остина — на этой неделе! — Музыка


Я не спешу писать свою последнюю волю и завещание, но ради документации, если ко мне подкрадется Жнец , я хочу, чтобы моя девушка присматривала за собакой, мои друзья дрались за мои записи, и моя мандолина похоронена со мной.Видите ли, завещания предназначены для людей с активами, которые вряд ли будут выброшены в мешок для мусора за пределами Goodwill . Меня больше волнует мой мемориальный концерт.

А что, если тебе нужно спланировать собственный мемориальный концерт? Кто будет играть и какие песни исполнять? Смертельно больной певец и автор песен Джимми ЛаФэйв собрал 21 лучшего друга для нежного набора своих песен и каверов в Paramount Theater в мае, а затем умер через три дня. Непревзойденная журналистка, сценарист и поклонница Маргарет Мозер , выписавшаяся в августе после приступа рака, который в конечном итоге превратился в круг почета, сделала еще один шаг вперед: спланировала свое собственное музыкальное поминки в деталях, а затем запланировала его. посмертно, чтобы она могла занять лучшее место в доме.

63-летний глава музыкального сообщества Остина лично выбрал место — Antone’s , где Lady Gaga материализовалась во вторник вечером после аншлагового шоу Erwin Center для неожиданного появления с частым соавтором Брайаном Ньюманом — благотворительные бенефициары ( SIMS , Girls Rock Camp , ее возлюбленный Музей популярной культуры Южного Техаса ) и двое ее профессиональных сыновей, перед которыми она лебезила с тех пор, как они были подростками, торгуя по средам в Club Foot , как руководители оркестра: Чарли Секстон и Монте Уорден .

Музыканты, которых она попросила собрать доказательства ее личности через доморощенную сцену: Джо Эли , Келли Уиллис , Кэти Валентайн , Рози Флорес , Джесси Саблетт , Чип50 Кинман 90.

«Никого не пригласили, никто не напросился», — говорит Смотритель о составе. «Все произошло органично».

Друзья, семья и поклонники проводят Маргарет в это воскресенье, с 14:00 до 18:00, у Антона. Билеты по 20 долларов уже в продаже.

Черный лад: куда уходят деньги?

Некоммерческая организация под патронажем отечественной музыки Black Fret за последние три года выделила более полумиллиона долларов музыкантам из Остина. Во время этой субботы Black Fret Ball в Paramount Theater они дарят еще 200 000 долларов номинированным артистам по результатам голосования их доноров. Что именно эти деньги помогают музыкантам? Давайте спросим у победителей прошлогоднего гранта в размере 17 000 долларов.

Рэй Прим: «Это был выстрел в руку», — говорит душевный автор песен, который был готов отказаться от своей 25-летней музыкальной карьеры, прежде чем был номинирован на грант Black Fret.Вместо этого он записал и выпустил сентябрьский альбом To Whom It May Concern .

Уокер Люкенс: Заклинатель абстрактных поп/рок-песен поставил новую резину на свой фургон и отправился в поездку по далеким странам, таким как Нью-Йорк, но «большая часть денег пошла на оплату моей группы, которая является величайшей вещью в мире».

Венди Колонна: « Вы должны выпустить пластинку до того, как выпустите ребенка, иначе пластинка никогда не выйдет», — рассказала певица и автор песен, которая использовала свой непредвиденный доход Black Fret для оплаты мастеринга, упаковки, продвижения, и видео для ее альбома No Moment but Now , которое прибыло незадолго до ее сына Чарли .

Дэн Дайер: Folk Crier наконец-то смог позволить себе записать альбом своей мечты, который скоро будет выпущен, записанный в Arlyn Studios с Band of Heathens в качестве группы и Beau Bedford из Texas Gentlemen продюсером .

Сюзанна Чоффель: «Я загорелась желанием создавать больше», — говорит певица, исполняющая фолк-поп песни. выпуск этого года Привет До свидания .

Пчелиные пещеры: «Все это ушло на студийные расходы на завершение нашего нового альбома, который выйдет в 2018 году», — рассказывает фронтмен яркой инди-рок-группы Рид Калхун .

Nakia: Подтвержденный CeeLo соул-поясник использовал грант в качестве поддержки тура для серии шоу в Испании и выпустил альбом ауттейков Wine to Water на компакт-диске и виниле. «Приятно иметь Black Fret прямо сейчас, когда звукозаписывающая индустрия превратилась в такое дерьмовое шоу», — улыбается он.

Карсон Макхоун: «Вместо того, чтобы покупать мою грандиозную идею альбома, я смогла сделать альбом для продажи лейблам, что дало мне творческий контроль», — говорит певица в стиле кантри, которая использовала свои грантовые деньги для записи с . Ложка / Пэтти Гриффин продюсер Майк Маккарти в Нэшвилле.

Номинации в Austin Music Poll

Демонстрируя полное пренебрежение законами об идентификации избирателей, «Playback» установила импровизированную кабину для голосования по адресу Saturnalia в минувшие выходные и собрала десятки бюллетеней для Austin Music Poll .Было воодушевляюще наблюдать, как избиратели-новички и старые лидеры радостно записывают свои любимые группы в бумажные бюллетени, и напоминали, что мы делаем это не для того, чтобы назидать нашу собственную публикацию, а чтобы дать сообществу возможность высказаться. На избирательной доске я смотрю бюллетени. Вот несколько моих любимых выводов из работ, получивших несколько голосов от Festers:

Лучшая электроника: Capyac

Лучший металл: Bridge Farmers

Лучший постер: F ez Moreno

Лучшая вокалистка: Линдси Веррилл

Лучшее клубное освещение: Электрическая церковь

Лучшая мировая музыка: Continental Drift

Лучший радио-диджей: Джон Айелли, KUTX

Лучшее место: Sahara Lounge

Лучший рок: Думай, не думай

Лучшая гитара: Джим Кампо (Magic Rockers of Texas)

Лучшая радиостанция: KVRX

Первичный раунд регистрации заканчивается в понедельник в полночь, поэтому, если вы еще не проголосовали, не пропустите.Второй раунд номинаций, в котором мнения фанатов смешиваются с экспертной информацией, дебютирует 5 января.

Половина банкнот

Сатурналии Было взрывом: группа Golden Dawn Arkestra использовала межпланетную мощь для потрясающего психоделического афро-диско, подкрепленного случайным спецэффектом самолета, оставляющего толстый инверсионный след, парящий над баптистской церковью Webberville Road Baptist Church земель. Среди других выдающихся личностей из родного города были Big Bill фронтмен Eric Braden , проверяющий возможности своего беспроводного микрофона с феноменальной пляской между аудиториями, Money Chicha приводивший в восторг упакованный Sahara Lounge с размытыми перуанскими канавками, и Amplified Heat освещая Восточный Остин пламенем братской смесью Motorhead , Hendrix и MC5 .Трансплантация Остина также стала ярким событием: Bushwick Bill компенсировал свое пятничное отсутствие тремя сетами, включая концерт в 3 часа ночи в субботу и долгий фристайл над местными интригами психоделического синтезатора Palm Daze в воскресенье. Между тем, новый Austinite Sam France из Foxygen предлагал набор устных слов, похожий на Andy Kaufman , включая религиозную евангелизацию и разглагольствования в музыкальной индустрии. Предварительные вечеринки в четверг и пятницу были переполнены, в то время как посещаемость в течение дня в субботу и воскресенье оказалась скромной, но дебют продемонстрировал звездное место, отличную атмосферу и что-то конкретное, на чем можно было основываться.

Медленно развивающаяся война торгов на eBay выставила аукцион Parish до 250 100 долларов за пять дней до конца. Победитель получает бренд плюс 12-летнюю аренду с базовой арендной платой, начинающейся с 9 667 долларов в его давнем месте на Шестой улице. Между тем, сюрреалистическая диско-банда Capyac отодвинула этот аукцион на задний план, разместив собственный список на eBay, продав все свои активы, включая участников группы. В настоящее время торги составляют $ 117,50.

Фестиваль левитации сегодня отказался от своей линейки, включая шоу, озаглавленные Electric Wizard , Slowdive , Резня Брайана Джонстауна , Черные ангелы и Министерство .Психологическое мероприятие, которое будет проходить с 26 по 29 апреля на площадках Red River плюс Emo’s , перестраивается после того, как погода отменила итерацию 2016 года, и в этом году они взяли перерыв. 2018 год возвращается как серия шоу с индивидуальными билетами, а не как фестиваль в стиле шведского стола. Смотрите полный список шоу в нашем ежедневном музыкальном блоге.

Игла пропускает? Неопределенность предусилителя? Не знаете, что означают эти цифры на вашем тонарме? Waterloo Records проводит бесплатный семинар по проигрывателям во вторник в 19:00, когда вы узнаете от экспертов, как добиться наилучшего звучания от вашей установки.

Обама ищет 14 миллиардов долларов для усиления защиты США от кибербезопасности для лучшей защиты федеральных и частных сетей от угроз взлома.

Мужчина печатает на клавиатуре компьютера в Варшаве на этом иллюстративном изображении от 28 февраля 2013 года.REUTERS/Kacper Pempel/Files

Федеральное финансирование кибербезопасности в последние годы неуклонно увеличивалось, что отражает интенсивность угроз, с которыми американские компании и государственные учреждения сталкиваются со стороны кибер-злоумышленников, как внутренних, так и иностранных.

Бюджет, опубликованный в понедельник, предусматривает развертывание дополнительных возможностей обнаружения и предотвращения вторжений, более широкий обмен данными с частным сектором и другими странами и увеличение финансирования для усиления способности правительства реагировать на атаки.

Финансирование предназначено для поддержки нескольких конкретных программ, таких как мониторинг и диагностика федеральных компьютерных сетей, система обнаружения и предотвращения вторжений EINSTEIN, а также общегосударственное тестирование и обучение реагированию на инциденты.

«Киберугрозы, нацеленные на частный сектор, критически важную инфраструктуру и федеральное правительство, демонстрируют, что ни один сектор, сеть или система не застрахован от проникновения тех, кто пытается украсть коммерческую или государственную тайну и собственность или совершить злонамеренную и подрывную деятельность», — Белый дом. резюме сказал.

Пока неясно, сколько средств контролируемый республиканцами Конгресс выделит на усилия по обеспечению кибербезопасности в течение следующего финансового года.

Среди различных запросов Белый дом запросил 227 миллионов долларов на строительство Гражданского кибер-кампуса, призванного стимулировать государственно-частное партнерство, и 160 миллионов долларов на информационные технологии и кибербезопасность программы вооружений в Национальном управлении ядерной безопасности Министерства энергетики.

Только в бюджете Пентагона требовалось 5 долларов.5 миллиардов в финансировании для кибербезопасности. Главный испытатель оружия агентства в прошлом месяце сообщил Конгрессу, что почти каждая программа вооружения США имеет «значительные уязвимости» для кибератак, включая неправильно сконфигурированное, неисправленное и устаревшее программное обеспечение.

Увеличение финансирования защиты правительственных сетей было бы хорошей новостью для крупных производителей оружия, таких как Lockheed Martin Corp LMT.N, General Dynamics Corp GD.N, Northrop Grumman Corp NOC.N и Raytheon RTN.N, которые уже играют большую роль в области кибербезопасности, шифрования и анализа для оборонных и спецслужб.

Ряд компаний среднего и меньшего размера также может получить выгоду, в том числе Science Applications International Corp SAIC.N, Booz Allen Hamilton BAH.N, CACI International CACI.N и Computer Sciences Corp CSC.N.

В частном секторе, где компании все больше обеспокоены атаками на магазины розничной торговли, банки и другие организации, более высокие расходы, вероятно, подстегнут такие компании, как Hewlett Packard HPQ.N, предлагающая услуги кибербезопасности.

Бюджет Белого дома для большинства агентств ссылался на их усилия по кибербезопасности, включая Министерство здравоохранения и социальных служб и Управление кадров.Обама также запросил не менее 28 миллионов долларов для директора по информационным технологиям Министерства сельского хозяйства для улучшения кибербезопасности агентства и 15 миллионов долларов для грантов, обучения и программы технической помощи ФБР, которая помогает местным правоохранительным органам бороться с экономическими, высокотехнологичными и интернет-преступлениями.

Репортаж Алины Селюх и Андреа Шалал; Дополнительный отчет Джеффа Мейсона; Под редакцией Дэна Греблера

Молитвы о раке – сильные слова для исцеления и утешения

В октябре 2013 года у меня диагностировали рак молочной железы.Я думал о раке каждый божий день с тех пор, как мне поставили диагноз. Ежедневные мысли о чем-то столь же страшном и смертельном, как рак, утомляют, если не сказать больше. Это моя жизнь. Возможно, другие выжившие после рака не думают о раке каждый день, но будьте уверены, что они думают о раке чаще, чем нет.

Рак, его побочные эффекты, влияние на вашу жизнь и вероятность рецидива могут доминировать в ваших мыслях, отвлекая вас от жизни с избытком, которую Христос пришел дать вам. А рак не навевает хороших мыслей.Рак приносит с собой негативные, пугающие мысли, целью которых является воровать, убивать и разрушать. Что делать больному раком или выжившему?

Вы не одиноки в этой борьбе с раком. Утешитель несет вас, мягко напоминая, что вы торжествуете во Христе. Итак, когда вы испытываете искушение беспокоиться из-за рака и связанных с ним уродливых мыслей, вы можете смело приближаться к престолу благодати, где вы найдете милость и благодать в час нужды.

Молитвы за больных раком:

Отец, Мы обращаемся к Тебе сейчас во имя Иисуса Христа, ходатайствуя за всех тех, кто столкнулся с раком.На ваших детей нападает не только эта немощь, но и мысли, которые наполняют их страхом и страхом.

И все же я знаю, что Твое слово говорит, что Ты дал нам не дух страха, но силы, любви и здравого ума. Господи, мы отбрасываем эти мысли и заботы и выбираем думать о Твоей благости и милости.

Молитва о непоколебимости ума

Мы предпочитаем думать о истинных, честных, справедливых, чистых, прекрасных и достойных похвалах вещах; вещи с добродетелью и похвалой.Мы выбираем думать о Вас. Ты хранишь своих детей в полном покое, когда их мысли сосредоточены на Тебе. Помогите своим детям сосредоточить свои мысли и чувства на вещах выше, а не на их диагнозах рака.

Храни их сердца со всем усердием. Не позволяй этим мыслям отдалить их от Тебя. Отец, Ты свят и справедлив. И Ты любишь их безоговорочно. Спасибо за то, что вы рядом со своими детьми в трудную минуту. Благодарю Тебя за то, что Ты послал Своего Сына, чтобы они могли иметь вечную жизнь.

Молитва о силе

Господь, я молюсь о постоянной силе выстоять. Я верю, что даже этот раковый диагноз пойдет им на пользу. Отец, благослови их семьи. Укрепите их. Я знаю, что нелегко смотреть, как близкий человек переносит диагноз рака. Обновите их разум и ободрите их. Убеди их, что они в Твоей ладони.

Молитва за врачей

Да благословит Отец всех их врачей. Дайте им мудрость, знание и понимание для лечения этих болезней.Будьте прославлены через их жизнь. Используйте их по своему усмотрению. Используйте их как инструмент хвалы. Используйте их как инструмент поклонения. Используй их как свидетельство Твоей доброты, благодати и милосердия. Используйте их, чтобы вселить надежду и веру в других.

Молитва о победе над раком

Мы доверяем Тебе даже посреди этого испытания. Будь прославлен, Отец. Господи, я запрещаю духу страха. Благодаря Вашей силе ваши дети не позволят страху завладеть их разумом или душой.У них есть победа над раком через Христа Иисуса. Помогите им всегда быть светом. Пусть другие смотрят на них и видят Христа, а не страдания. Пусть другие смотрят на них и видят надежду и здоровье, а не смерть.

Отец, Ты Бог всякого утешения. Используйте их, чтобы утешать других тем утешением, которое даете вы.

Благодарю Тебя, Господи, за все, что Ты делаешь для своих детей. Спасибо, что любишь, защищаешь и исцеляешь нас. Спасибо Вам за то, что Вы наш замечательный врач.Никогда не лишай нас Твоего присутствия. Он нужен нам в жизни и смерти.

Во имя Иисуса,

Аминь.

Писание для ободрения и утешения больных раком:

Библия полна стихов утешения, силы, веры и надежды. Вот некоторые из них, которые я использовал в молитве:

«Ты будешь хранить в совершенном мире тех, чей разум тверд, потому что они уповают на Тебя». Исаия 26:3

«И мы знаем, что Бог во всем содействует ко благу любящих Его, призванных по Его изволению.» Римлянам 8:28

«Ибо, живя в мире, мы не воюем, как мир». 2 Коринфянам 10:3

«О горнем помышляйте, а не о земном». Колоссянам 3:2

«Ибо Дух, который дал нам Бог, не делает нас робкими, но дает нам силу, любовь и самодисциплину. » 2 Тимофею 1:7

«Наконец, братья и сестры, о том, что истинно, что благородно, что правильно, что чисто, что прекрасно, что достославно, что превосходно или похвально, подумайте о такие вещи. » Филиппийцам 4:8

«Все заботы ваши возложите на Него, потому что Он заботится о вас». 1 Петра 5:7

«Вор приходит только для того, чтобы украсть, убить и погубить: Я пришел для того, чтобы имели жизнь и имели с избытком». 1 Иоанна 10:10

«И Я умолю Отца, и даст вам другого Утешителя, да пребудет с вами вовек… Не оставлю вас без утешения: приду к вам». Иоанна 14:16,18

Я рекомендую найти места Писания, которые наполняют вас надеждой, записать их на каталожных карточках и носить с собой.Они будут источником утешения, когда вы будете жить как человек, переживший рак.

Христос не оставил нас без Утешителя. Утешитель идет рядом с нами, чтобы помочь нам, утешить нас, заступиться за нас. Он наш адвокат. Утешитель, говорящий через Писание, напоминает нам, что Бог с нами и что Он обещал никогда не оставить нас и не покинуть нас.

«Я был молод, и [теперь] состарился; но не видел я праведника оставленным и потомков его просящими хлеба» (Псалтирь 37:25).

Благослови вас Бог.

Арета Грант служит в местной церкви в качестве библейского учителя и старейшины. Она любит писать и является автором книги «Преодоление: 25 ключей к победе». Арета живет в Хагерстауне, штат Мэриленд, со своим мужем и двумя младшими детьми. Вы можете прочитать блог Ареты на сайте www.arethagrant.com.

Роль тестирования ADAMTS13 в подозрении на тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру

25-летняя женщина с 2-недельным анамнезом инфекции верхних дыхательных путей поступила в отделение неотложной помощи вашей больницы с лихорадкой, сильной головной болью и спутанностью сознания.КТ не выявляет острого внутричерепного процесса. Однако у нее имеется ряд лабораторных отклонений, в том числе выраженная анемия (гематокрит 19%, референсный интервал 34–47%) и тромбоцитопения (15 к/мкл, референсный интервал 180–405 к/мкл), заметно повышенная лактатдегидрогеназа (10–50 ЕД/л, референтный интервал 100–253 ЕД/л), отсутствие гаптоглобина (<10 мг/дл, референтный интервал 30–200 мг/дл) и повышенный общий билирубин плазмы (3,1 мг/дл, референсный интервал 0,2–1,4 мг). /дл), где непрямая дробь равна 2.1 мг/дл.

Кроме того, у этого пациента отрицательный прямой и непрямой антиглобулиновый тест (Кумб), нормальный уровень креатинина в плазме и нормальные параметры коагуляции, включая протромбиновое время (ПВ), активированное частичное тромбопластиновое время (аЧТВ), фибриноген и только минимально повышенный уровень d-димера. . Мазки периферической крови показывают тяжелую тромбоцитопению и частые шистоциты, составляющие 1–2% эритроцитов (также идентифицированные как 4+ шистоцитов автоматическим гематологическим анализатором), что подтверждает микроангиопатическую гемолитическую анемию (МАГА).

В связи с совокупностью клинических и лабораторных данных рабочим диагнозом этого пациента является тромботическая тромбоцитопеническая пурпура (ТТП) — требуется неотложная медицинская помощь. Ее врач назначает тестирование ADAMTS13 (дезинтегрин и металлопротеаза с мотивами тромбоспондина 1 типа 13) и госпитализирует ее для проведения экстренного терапевтического плазмафереза ​​(ТПЭ). Какие анализы вы бы использовали и как бы вы интерпретировали результаты для этой женщины с подозрением на ТТП?

В этом обзоре рассматривается использование тестирования ADAMTS13 при оценке пациентов с подозрением на ТТП, редкую тромботическую микроангиопатию (ТМА), чаще всего связанную с приобретенными аутоантителами к ADAMTS13, вызывающими тяжелую недостаточность ADAMTS13.

ADAMTS13, протеаза, также известная как протеаза, расщепляющая фактор фон Виллебранда (VWF), регулирует размер мультимеров VWF и является важным медиатором адгезии тромбоцитов. ADAMTS13 регулирует размер VWF путем расщепления специфической пептидной связи в домене A2. Без этой регуляции увеличение мультимеров фактора Виллебранда сверхвысокой молекулярной массы приводит к микрососудистым тромбоцитарным тромбам, разрушающим эритроциты и тромбоциты и нарушающим приток крови к жизненно важным органам, таким как мозг и почки.

Хотя ТТП часто сопровождается микроангиопатической гемолитической анемией, тромбоцитопенией, лихорадкой, неврологическими симптомами и почечной недостаточностью, у многих пациентов не наблюдается полной пятерки симптомов.Кроме того, такая же комбинация аномалий может присутствовать при других заболеваниях, таких как классический гемолитико-уремический синдром (ГУС), атипичный ГУС (аГУС) или диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови (ДВС-синдром). При высоком клиническом подозрении на ТТП необходимо немедленно начать спасательную терапию. На самом деле, до появления современных методов лечения это расстройство имело 90% смертность.

ТТП клинически определяется как МАГА и тромбоцитопения у пациента без альтернативной причины. Оценки клинического прогноза с использованием легкодоступной лабораторной информации (креатинин, количество тромбоцитов, d-димер, процентное содержание ретикулоцитов, непрямой билирубин и т. д.).) оказались полезными для быстрого принятия решений. Первоначальный терапевтический режим для приобретенной ТТП включает иммуносупрессию и ТПО для подавления образования антител, снижения титра антител и обеспечения дополнительного ADAMTS13. Хотя подтверждение серьезного снижения активности ADAMTS13 помогает установить диагноз ТТП, терапию необходимо начинать еще до того, как будут доступны результаты анализов.

Преаналитические переменные

Качество результатов тестирования ADAMTS13 зависит от нескольких важных предварительных аналитических вопросов.Во-первых, и это очень важно, диагностические образцы должны быть собраны до начала терапии, поскольку лечение изменяет уровни ADAMTS13. Как и в случае других тестов на коагуляцию, цитратная обедненная тромбоцитами плазма является образцом выбора для теста ADAMTS13. Плазма с ЭДТА неприемлема, поскольку ADAMTS13 представляет собой металлопротеиназу, и этот антикоагулянт сильно хелатирует ионы металлов, которые необходимы для его функции. Даже плазма от нормальных контрольных людей, подвергшихся воздействию ЭДТА, будет демонстрировать отсутствие активности ADAMTS13. Поскольку тромбин разрушает ADAMTS13, также лучше не тестировать образцы сыворотки, которые готовятся путем свертывания крови.Точно так же гемолизированная плазма (особенно если концентрация гемоглобина > 2 г/л) вызывает беспокойство, поскольку свободный гемоглобин ингибирует активность ADAMTS13. Следовательно, лаборатории должны позаботиться о том, чтобы не вызвать гемолиз in vitro во время сбора и подготовки образцов. Поскольку у пациентов, проходящих первичное диагностическое обследование, может наблюдаться активный внутрисосудистый гемолиз, некоторое количество свободного гемоглобина в плазме может быть неизбежным. Плазму, которую невозможно протестировать в течение 4 часов после сбора, следует заморозить до времени тестирования.Следует избегать многократных циклов замораживания-оттаивания.

Тестирование активности ADAMTS13

Измерение активности ADAMTS13 является наиболее часто используемым лабораторным тестом при подозрении на ТТП. При приобретенной ТТП аутоантитела могут ингибировать функцию, связываясь с функциональными областями ADAMTS13 (нейтрализуя), вызывая ускоренный клиренс ADAMTS13 (ненейтрализуя), или посредством как нейтрализующего, так и ненейтрализующего действия. Методы деятельности являются выбором первой линии, поскольку они чувствительны ко всем этим дефектам.Лаборатории редко используют анализы на антигены из-за их нечувствительности к чисто нейтрализующим ингибиторам.

Несмотря на то, что это технически сложно и требует много времени, лаборатории изначально использовали разработанные в лаборатории тесты (LDT) для измерения активности ADAMTS13. Однако теперь доступен ряд коммерческих наборов, но ни один из них не был одобрен Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов. В коммерческих тестах используются синтетические пептиды фактора Виллебранда, которые включают сайт расщепления ADAMTS13. Хотя эти анализы легко проводить на широкодоступном лабораторном оборудовании и получать результаты в течение 1–3 часов, многие центры направляют тестирование в региональные или национальные референс-лаборатории, поскольку лечение TTP начинается до получения результатов, а тестирование, как правило, должно проводиться партиями для снижения затрат. эффективный.Лаборатории, которые проводят тестирование ADAMTS13, должны делать это, сохраняя критический характер TTP в центре внимания, уделяя первоочередное внимание оптимизации времени выполнения работ.

Наиболее широко используемыми анализами активности являются методы флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) с использованием пептида фактора Виллебранда (VWF73), содержащего флуоресцентную часть и гаситель флуоресценции, которые располагаются по бокам сайта расщепления ADAMTS13. Расщепление субстрата с помощью ADAMTS13 приводит к флуоресцентной эмиссии, прямо пропорциональной активности протеазы.Однако методы FRET, которые измеряют активность ADAMTS13 в растворе без стадий захвата и промывки, могут недооценивать активность в желтушных образцах с концентрацией билирубина в плазме >100 мкмоль/л, поскольку билирубин может подавлять флуоресцентную эмиссию. Это влияние зависит от того, какой флуоресцентный субстрат используется, и может быть сведено к минимуму путем тестирования разбавленного образца.

Более новый анализ активности с определением хромогенной конечной точки также использует пептид VWF73. Однако вместо того, чтобы обнаруживать расщепление субстрата непосредственно по флуоресцентному излучению, расщепление пептида в иммуноферментном анализе этой активности (ELISA) выявляет специфическую аминокислотную последовательность, которую обнаруживает антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена (HRP).Последующая реакция HRP приводит к развитию окраски.

В дополнение к этим распространенным методам некоторые лаборатории используют LDT для тестирования активности ADAMTS13 с использованием доступных синтетических субстратов. К ним относятся методы LDT FRET или более необычные методы, такие как обнаружение продуктов расщепления с помощью масс-спектрометрии.

Результаты активности

ADAMTS13 были выражены в процентах от нормальной активности, единиц/мл или нг/мл, в зависимости от используемого набора и калибраторов.

Следует отметить, что Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) недавно установила первый международный стандарт ВОЗ для плазмы ADAMTS13, который может улучшить гармонизацию между лабораториями.До недавнего времени ни в одном коммерческом опросе по проверке квалификации не предлагалась оценка тестирования ADAMTS13. Однако несколько организаций, в том числе Колледж американских патологоанатомов и Североамериканская ассоциация специализированных лабораторий коагуляции, добавили ADAMTS13 в свои исследования коагуляции.

Тяжелый дефицит, определяемый в литературе как <10% от нормальной активности, по-видимому, имеет хорошую чувствительность (около 90%) и специфичность (приблизительно 90% или выше) для ТТП, хотя существует некоторая вариабельность в зависимости от используемых наборов данных и определений. .Исследования также показали, что тяжелый дефицит предсказывает хороший ответ на ТПО, при этом примерно 80-90% пациентов с тяжелым дефицитом реагируют на терапию первой линии. Клиницисты определяют продолжительность ТПО на основе восстановления количества тромбоцитов и разрешения гемолиза и неврологических симптомов, а не восстановления активности ADAMTS13. Хотя тяжелый дефицит ADAMTS13 предсказывает хороший ответ на TPE, он также предвещает значительный риск рецидива заболевания, который происходит по крайней мере в одной трети случаев.У некоторых пациентов наблюдается тяжелый дефицит ADAMTS13 даже во время клинической ремиссии, что, вероятно, является высокопрогнозирующим фактором риска рецидива.

Снижение активности ADAMTS13 от легкой до умеренной степени можно наблюдать при различных заболеваниях из-за снижения синтеза или повышенного потребления, поэтому сам по себе этот результат не является диагностическим признаком ТТП. Сообщалось об очень редких случаях ТТП с минимальным дефицитом или даже без дефицита. И наоборот, о тяжелом дефиците редко сообщалось при других состояниях. Лаборатории и поставщики заказов должны подходить к таким необычным результатам с большой осторожностью.

Тесты на антитела ADAMTS13

В дополнение к тестированию активности ADAMTS13 лаборатории все чаще проводят тесты на аутоантитела ADAMTS13. Выявление причинных антител может помочь подтвердить диагноз ТТП и предоставить прогностическую информацию, связанную с реакцией на ТПО и риском рецидива. Тестирование аутоантител к ADAMTS13 также позволяет дифференцировать приобретенную ТТП от редких случаев наследственной ТТП, вызванной мутациями ADAMTS13 (синдром Апшоу-Шульмана).

Анализы ADAMTS13 Bethesda выявляют антитела, нейтрализующие функцию, которые присутствуют примерно в двух третях случаев TTP.Они аналогичны традиционным анализам Bethesda, используемым для обнаружения и титрования ингибиторов фактора свертывания крови VIII или IX. Они включают инкубацию плазмы пациента с нормальной объединенной плазмой, чтобы определить, является ли восстановление активности ADAMTS13 в смеси ниже ожидаемого из-за антитела пациента. Количество ингибитора, снижающее остаточную активность до 50% от ожидаемой, определяется как 1 единица Бетесда (BU). Анализы Bethesda — это LDT, в которых используются коммерческие анализы активности для измерения остаточной активности ADAMTS13 в смесях.Упомянутые ранее вещества, которые могут влиять на анализы активности, такие как гемоглобин и билирубин, также влияют на идентификацию и количественный анализ антител в анализах Bethesda и могут вызывать ложноположительные результаты или ложно повышенные титры антител.

Поскольку приблизительно одна треть случаев ТТП связана с антителами, которые не нейтрализуют функцию, анализы в стиле Bethesda не выявляют подмножество патогенных антител. Однако анализы ELISA, в которых планшет для ELISA покрыт полноразмерным рекомбинантным ADAMTS13, идентифицируют последний.Для этой цели доступны коммерческие наборы ELISA. Интересно, что с помощью ИФА антитела к ADAMTS13 были обнаружены у небольшого процента здоровых людей. Поскольку ИФА более чувствителен, а тесты Bethesda более специфичны, алгоритм рефлексивного тестирования, вероятно, является оптимальным подходом для обнаружения антител.

Широко используемый рефлекторный алгоритм сначала измеряет активность ADAMTS13, а в случае ее недостаточности — рефлексы на тест Bethesda. Этот алгоритм требует выполнения теста на антитела ELISA только в том случае, если анализ Bethesda не обнаруживает антител.Из-за технических ограничений анализов и некоторых аспектов патофизиологии ТТП может быть подгруппа приобретенных случаев ТТП, в которых антитело ADAMTS13 не может быть идентифицировано. Например, методология Bethesda, как правило, не может обнаруживать титры антител ниже 0,5 BU, а анализы Bethesda и ELISA не способны обнаруживать антитела, связанные с ADAMTS13 в циркулирующих иммунных комплексах.

Генетическое тестирование

Несколько клинических лабораторий предлагают секвенирование гена ADAMTS13, которое может помочь идентифицировать мутации, ответственные за наследственную ТТП.Кроме того, отсутствие мутации может помочь исключить наследственную форму в сложных случаях, например, когда тесты на антитела не выявляют аутоантитела. На рисунке 1 изображен алгоритм тестирования ADAMTS-13, включающий тесты на активность, антиген и генетические тесты.

Заключение по делу 

Возвращаясь к нашему первому случаю, клиницисты подтвердили рабочий диагноз пациента приобретенной ТТП на основании лабораторных данных о тяжелом дефиците ADAMTS13 (<5% нормальной активности) и ингибиторе ADAMTS13 1.8 ЯБ, выявленные при тестировании острых (до терапии) образцов. Ее первоначальный анамнез и лабораторные результаты в значительной степени исключали другие процессы, связанные с микроангиопатической гемолитической анемией и тромбоцитопенией, такие как ГУС, аГУС и ДВС-синдром.

Активность

ADAMTS13, хотя и недоступна сразу как часть начального обследования, является полезным дифференцирующим фактором при рассмотрении этих возможностей, поскольку эти другие болезненные состояния не связаны с тяжелым дефицитом ADAMTS13. При этих болезненных состояниях можно наблюдать снижение активности от легкого до умеренного из-за негативного воздействия воспаления и тяжелого заболевания на выработку и/или выживание ADAMTS13.В таблице 1 приведены тесты, полезные при оценке подозрения на ТТП.

Пациент хорошо ответил на ТПО и иммуносупрессию преднизоном. Действительно, ее головная боль и спутанность сознания полностью исчезли после однократного обмена, количество тромбоцитов полностью восстановилось, а гемолиз прекратился после еще нескольких обменов. Повторное тестирование ADAMTS13 во время клинической ремиссии выявило постоянно низкую, но улучшенную активность ADAMTS13 на уровне 15% от нормы и сохранение низкого уровня ингибитора на уровне 0.6 БУ. Из-за высокого риска рецидива приобретенной ТТП она находится под пристальным наблюдением на предмет рецидива заболевания, особенно во время воспаления или стресса, такого как болезнь, операция или беременность.

Заключение

Лабораторные исследования

ADAMTS13 предоставляют ценную информацию, которая помогает в диагностике, лечении и прогнозировании ТТП. В то время как активность ADAMTS13 является основой этого тестирования, растущий объем медицинской литературы поддерживает полезность тестирования на антитела.Лабораторные работники, вооруженные знаниями о характеристиках тестов и их надлежащем клиническом применении, могут внести значительный вклад в уход за пациентами с этим опасным для жизни заболеванием.

Рекомендуемая литература

1.       Barrows BD, Teruya J. Использование анализа активности ADAMTS13 повысило точность и эффективность диагностики и лечения предполагаемой приобретенной ТТП. Arch Pathol Lab Med 2014; 138: 546–9.

2.       Bentley MJ, Wilson AR, Rodgers GM.Эффективность оценки клинического прогноза ТТП в независимой когорте. Vox Sang 2013; 105: 313–18.

3.       Джордж Дж. Н. Как я лечу пациентов с ТТП: 2010. Blood 2010;116:4060–9.

4.       Хаббард А.Р., Хит А.Б., Кремер Ховинга Дж.А., Подкомитет по фактору фон Виллебранда. J Thromb Haemost 2015; 13:1151–3.

5.       Mannucci PM, Canciani MT, Forza I и др. Изменения в норме и болезни металлопротеазы, расщепляющей фактор фон Виллебранда. Кровь 2001; 98: 2730–5.

6.       Meyer SC, Sulzer I, Lammle B, et al. Гипербилирубинемия мешает измерению активности ADAMTS-13 с помощью анализа FRETS-VWF73: диагностическая значимость у пациентов, страдающих острыми тромботическими микроангиопатиями. Дж. Тромб Хемост, 2010; 5:866–7.

7.       Пейванди Ф., Палла Р., Лотта Л.А. и соавт. Анализы ADAMTS-13 в ТТП. J Thromb Haemost 2010; 8: 631–40.

8.       Rieger M, Mannucci PM, Kremer Hovinga JA, et al. Аутоантитела к ADAMTS13 у больных с тромботическими микроангиопатиями и другими иммуноопосредованными заболеваниями.Кровь 2005; 106: 1262–7.

9.       Садлер Дж. Э. Фактор фон Виллебранда, ADAMTS13 и TTP. Кровь 2008; 112: 11–8.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.