Лада гранта максимальная скорость: Максимальная скорость гранты — 190 км/час. Видео

Содержание

Максимальная скорость гранты — 190 км/час. Видео

Итак, давайте рассмотрим такое понятие, как максимальная скорость Гранты, и попробуем ответить на некоторые вопросы.

До скольких километров в час способна разогнаться Лада Granta?
Какую скорость развили вы на своей Гранте по трассе?  В какой модификации?
Оставался ли при этом какой-то запас мощности, или Вы давили на «всю гашетку»?
Как чувствовали Вы себя при этом? Комфортно или не очень?

Теоретически, по паспорту, Гранта способна развить максимальную скорость в 167 км/час (это в комплектации «Норма» 1,6 л 8-кл., 87 л.с. с механической коробкой ПП).

На практике же, я встречал человека, который на новом отрезке трассы (по «Волгоградке») разгонял свою Гранту до 170 км/час. При выключенном кондиционере. Говорил, что запас мощности ещё был, но ехать было уже совсем не комфортно.

Вот, посмотрите реальное видео, где человек разогнал Ладу Гранта до 190 км/час. Честно — я бы не стал этого делать))

Далее отвечаю за себя.

Я свою Ладу Granta максимально разгонял до 150+км/час. Скажу откровенно, я не пытался поставить некий рекорд скорости для Гранты, а просто хотел попробовать, на какой максимальной скорости я буду чувствовать себя относительно комфортно в плане безопасности и управляемости. Также мне было интересно, какой уровень шума будет в салоне на максимальной скорости.

Так вот, 150+ моя машинка (комплектация «Норма-1», 87 л.с. ) выдаёт на «Ура!». И, на первый взгляд, запас мощности при этом остаётся значительный. Но дальше разгоняться и ставить рекорд скорости совсем не было желания, поскольку машина вела себя не так уверенно на трассе, как скажем, при скорости в 100-110 км/час. Во-первых, повышенная парусность оч сильно влияет на управляемость и авто реагирует на руль уже не так предсказуемо, как на более низких скоростях. Также и встречные фуры буквально сносят нашу довольно высокую машину.

Вывод прост. Разгонять свою машину до максимума или ездить спокойно и комфортно — решать только вам! Лихачить попусту, в общем-то, ни к чему. Для этого есть спортивные машины и специальные трассы 😉

Удачи на дорогах!

PS. До ~170 разгонял. Дальше — реально страшно.

Максимальная скорость, км/ч Lada Granta

Максимальная скорость большинству водителей нужна только ради интереса. Люди смотрят на цифру и не разу не пытаются ее достичь, так как этот показатель далеко не самый главный в автомобиле. Лошадиная сила — довольно странная метрика, но по ней можно ориентироваться. Вообще в России и Европе 1 лошадиная сила обозначала, что такая мощность способна поднять груз весом в 75 кг на 1 метр.

Максимальная скорость автомобиля Lada Granta разная — от 162 до 180 км/ч. Это зависит от мотора, снятых ограничителей и КПП, которую выбирает покупатель Lada Granta.

Для примера Максимальная скорость, км/ч у конкурентов Lada Granta:

  • Renault Logan – 163;
  • Datsun On-Do – 166;

Lada Granta

К обзору→
Комплектация Максимальная скорость, км/ч Индекс мотора
1. 6 MT Club 180 ВАЗ-11186
1.6 MT Luxe 180 ВАЗ-11186
1.6 MT Luxe 180 ВАЗ-11186
1.6 MT Classic
180
ВАЗ-11186
1.6 MT Classic + пакет Optima 180 ВАЗ-11186
1.6 MT Comfort 180 ВАЗ-11186
1.6 MT Standart 170 ВАЗ-11186
1. 6 MT Classic
179
ВАЗ-11182
1.6 MT Classic + пакет Optima 179 ВАЗ-11182
1.6 MT Club 179 ВАЗ-11182
1.6 MT Comfort 179 ВАЗ-11182
1.6 MT Luxe 179 ВАЗ-11182
1.6 MT Standart 179 ВАЗ-11182
1.6 AT Club 165 ВАЗ-21126
1. 6 AT Luxe 165 ВАЗ-21126
1.6 AT Comfort 165 ВАЗ-21126
1.6 AT Luxe 165 ВАЗ-21126
1.6 MT Club 180 ВАЗ-21127
1.6 MT Drive Active Comfort 162 ВАЗ-21127
1.6 MT Luxe 180 ВАЗ-21127
1.6 MT Luxe + пакет Prestige 180 ВАЗ-21127
1. 6 MT Comfort 180 ВАЗ-21127
1.6 MT Luxe 180 ВАЗ-21127
1.6 MT Luxe + пакет Prestige 180 ВАЗ-21127
1.6 AMT Drive Active Comfort
162 ВАЗ-21127
1.6 AMT Luxe 180 ВАЗ-21127
1.6 AMT Luxe + пакет Prestige 180 ВАЗ-21127
1.6 AMT Luxe 180 ВАЗ-21127
1.
6 AMT Luxe + пакет Prestige
180 ВАЗ-21127
1.6 AMT Classic + пакет Optima 180 ВАЗ-21127
1.6 AMT Comfort 180 ВАЗ-21127

Максимальная скорость, км/ч у конкурентов

Автомобиль Комплектация Максимальная скорость, км/ч
Renault Logan
1.6 MT Access
163 Посмотреть
Datsun On-Do 1.6 AT Trust II 166 Посмотреть

Другие параметры Lada Granta

Размеры и вес автомобиля Lada Granta Дорожный просвет (клиренс) Lada Granta Мощность двигателя Lada Granta Крутящий момент двигателя Lada Granta Объем багажника автомобиля Lada Granta Объем двигателя Lada Granta Объем топливного бака Lada Granta Разгон до 100 км/ч Lada Granta Расход топлива Lada Granta Тип привода Lada Granta Коробка передач в Lada Granta Сколько мест в Lada Granta

ВАЗ Granta Седан — разгон до 100 км/ч

UP-100.

RU

Разгон до 100км/ч


всех авто мира

Разгон от 0 до 100 км/ч автомобиля ВАЗ Granta Седан в секундах.

В таблице перечислены все возможные конфигурации данной модели и указаны базовые характеристики двигателя: объем, максимальная мощность, максимальный крутящий момент и максимальная скорость.

Реальная скорость разгона обычно немного ниже, чем в данных, предоставленных производителем, вследствие многих факторов, таких как, например, нештатный размер колес и дисков, износ двигателя и трансмиссии, степень загрузки автомобиля, дорожные условия. Также необходимо учитывать, что показания спидометра выше реальной скорости. На 100км/ч погрешность составляет порядка 3-10км/ч.

Модификации (5)

Модель Конфигурация Макс. скорость Разгон 0-100 км/ч
ВАЗ Granta Седан 1. 6 MT (106 л.с.), 148 Н*м /4000 об.
(2013 — )
177 км/ч 11.0 сек.
ВАЗ Granta Седан 1.6 MT (87 л.с.), 140 Н*м /3800 об.
(2011 — )
167 км/ч 11.8 сек.
ВАЗ Granta Седан 1.6 AT (98 л.с.), 145 Н*м /4000 об.
(2012 — )
170 км/ч 12.0 сек.
ВАЗ Granta Седан 1.6 MT (98 л.с.), 145 Н*м /4000 об.
(2011 — )
175 км/ч 12.0 сек.
ВАЗ Granta Седан 1.6 MT (82 л.с.), 132 Н*м /3500 об.
(2011 — )
164 км/ч 12.5 сек.

Сравнить с другими авто

Кто быстрее (15237) МаркаACAcuraAlfa RomeoAlpineAM GeneralArielAroAsiaAston MartinAudiAustinAutobianchiBaltijas DzipsBeijingBentleyBertoneBitterBMWBMW AlpinaBrabusBrillianceBristolBuforiBugattiBuickBYDByvinCadillacCallawayCarbodiesCaterhamChanganChangFengCheryChevroletChryslerCitroenCizetaCoggiolaDaciaDadiDaewooDAFDaihatsuDaimlerDallasDatsunDe TomasoDeLoreanDerwaysDodgeDongFengDoninvestDonkervoortE-CarEagleEagle CarsEcomotorsFAWFerrariFiatFiskerFordFotonFSOFuqiGeelyGeoGMCGonowGreat WallHafeiHaimaHindustanHoldenHondaHuangHaiHummerHyundaiInfinitiInnocentiInvictaIran KhodroIsderaIsuzuIVECOJACJaguarJeepJensenJMCKiaKoenigseggKTMLamborghiniLanciaLand RoverLandwindLexusLiebao MotorLifanLincolnLotusLTILuxgenMahindraMarcosMarlinMarussiaMarutiMaseratiMaybachMazdaMcLarenMegaMercedes-BenzMercuryMetrocabMGMicrocarMinelliMiniMitsubishiMitsuokaMorganMorrisNissanNobleOldsmobileOpelOscaPaganiPanozPeroduaPeugeotPiaggioPlymouthPontiacPorschePremierProtonPUCHPumaQorosQvaleReliantRenaultRenault SamsungRolls-RoyceRonartRoverSaabSaleenSantanaSaturnScionSEATShuangHuanSkodaSmartSoueastSpectreSpykerSsang YongSubaruSuzukiTalbotTATATatraTazzariTeslaTianmaTianyeTofasToyotaTrabantTramontanaTriumphTVRVauxhallVectorVenturiVolkswagenVolvoVortexWartburgWestfieldWiesmannXin KaiZastavaZotyeZXЁ-мобильАвтокамАстроБронтоВАЗГАЗЗАЗЗИЛИЖКамАЗМосквичСМЗСеАЗТагАЗУАЗUltimaHawtaiRenaissanceМодельКто медленнее (8475)

Технические характеристики Lada Granta (Лада Гранта)

Новая Лада Гранта построена на базе модели Калина, вначале автомобиль будет выпускаться в кузове седан, а с 2013 года появится и хэтчбек.

Автомобиль предлагается в трех комплектациях: «Стандарт», «Норма» и «Люкс». Версия в комплектации «Стандарт» получила 1,6-литровый мотор от Калины, две другие предлагаются с новым 8-клапанным силовым агрегатом объемом 1,6 литра мощностью 80 и 90 л.с., соответственно. Коробка передач — механическая 5-ступенчатая, привод на передние колеса.

Все варианты двигателей работают на бензине АИ-95, их средний расход от 8,7 до 9,3 литров на сотню в городе, от 5,8 до 6,1 литра — за городом и от 7,2 до 7,3 литров — в смешанном цикле.

Максимальная скорость самой мощной модификации Лады Гранта, по данным производителя, составляет 168,5 км/ч. Разгон с места до сотни у нее же занимает 12,0 секунд.

Более подробные технические характеристики Лада Гранта смотрите в приведенной ниже таблице. Стоимость Лада Гранта можно узнать в соответствующем разделе сайта.

Таблица технических характеристик Лада Гранта (ВАЗ-2190)
Автомобиль Лада Гранта (ВАЗ-2190)
Модификация «Стандарт» «Норма» «Люкс»
Тип кузова Четырехдверный седан
Число мест 5
Длина, мм 4260
Ширина, мм 1700
Высота, мм 1500
База, мм 2470
Колея передняя, мм 1430
Колея задняя, мм 1410
Педений свес, мм 810
Задний свес, мм 980
Мин. дорожный просвет, мм 160
Объем багажника, л 500
Масса снаряженная, кг 1040 1080 1100
Распределение снаряженной массы по передней/задней осям, % 59/41 59/41 59/41
Полезная нагрузка, кг 475
Полная масса, кг 1515 1555 1575
Распределение полной массы по передней/задней осям, % 50/50 50/50 50/50
Масса прицепа с тормозами/без тормозов, кг 900/450
Коэффициент аэродинамического сопротивления 0,367 0,353
Двигатель Бензиновый, с распределенным прыском
Обозначение двигателя ВАЗ-11183 ВАЗ-21116
Расположение спереди, поперечно
Число и расположение цилиндровов 4, в ряд
Рабочий объем, см3 1597
Диаметр цилиндра/ход поршня, мм 82,0/75,6
Степень сжатия 9,8:1 10,5:1
Число клапанов 8
Максимальная мощность, л. с./кВт/об/мин 80/59/5600 90/66/5600
Максимальный крутящий момент, Нм/об/мин 132/3500 143/3500
Коробка передач механическая, 5-ступенчатая
Привод передний
Передняя подвеска независимая, пружинная, McPherson
Задняя подвеска полузависимая, пружинная
Передние тормоза дисковые, вентилируемые
Задние тормоза барабанные
Шины 175/70 R13 175/65 R14
Максимальная скорость, км/ч 164,5 167,0 168,5
Время разгона от 0 до 100 км/ч, с 12,5 11,8 12,0
Расход топлива, л/100км  
— в городском режиме 9,3 8,5 8,7
— в загородном режиме 6,1 5,7 5,8
— в смешанном режиме 7,3 7,2 7,3
Выбросы CO2, г/км (смешанный цикл) 177 164 164
Емкость топливного бака, л 50
Топливо Бензин АИ-95

Скачать руководство по эксплуатации Лада Гранта


Зачем нужен и откуда берется параметр «максимальная скорость автомобиля».

(На примере Lada Granta). | Men’s theme (Мужская тема).

Многие видели в описании автомобиля параметр максимальная скорость, но не многие задумывались, зачем его указывают, все равно, с такой скорость никто не передвигается, да и разогнаться до нее будет весьма проблематично.

Чтобы разобраться зачем нужен параметр «максимальная скорость», нужно выяснить откуда он берется. Для примера возьмем автомобиль Lada Granta, он удобен тем, что в своих комплектациях имеет разные двигатели с максимальной мощностью на разных оборотах, и разными коробками передач, при этом, по сути одна и та же машина имеет разную максимальную скорость.

Разные двигатели, с разными коробками на Lada Granta.

Разные двигатели, с разными коробками на Lada Granta.

Давайте рассчитаем максимальную скорость на комплектации с восьми клапанным двигателем и пятиступенчатой коробкой передач. Расчет усилий на колеса выглядит примерно так:

Силы действующие на автомобиль.

Силы действующие на автомобиль.

Поэтому пойдем по очень упрощенной схеме, допустим что максимальная скорость достигается на оборотах соответствующих максимальной мощности (в реальности максимальная скорость где-то между максимальным крутящим и максимальной мощностью, после пика крутящего момента, начинается небольшой спад, но момента все еще хватает чтобы преодолеть силы трения воздуха и общего дорожного сопротивления, а т.к. обороты растут, то и скорость растет). Обороты двигателя (5100 об/мин.) делим на передаточное число коробки передач (на гранте у нас 2 ступени преобразования оборотов: главная передача — 3,706 и непосредсвенно передачи, максимальная скорость достигается на пятой — 0,784 ), получаем 1755 об/мин. — количество оборотов оси колеса в минуту. Колеса в базе стоят 175/65r14, значит за 1 оборот колеса машина пройдет 1,83 метра. Исходя из этого, получаем максимальную скорость в 192,7 км/ч.. Как видим, значение получилось больше, чем указывает производитель, это связано и с нашим упрощением, и с КПД агрегатов автомобиля, и с сопротивлением среды.

Аналогичным способом рассчитаем максимальную скорость для второй комплектации. Здесь стоит такая же точно коробка передач, но двигатель более мощный, и максимальная мощность достигается на больших оборотах. 219,2 км/ч. — как видим, прибавка в мощности и оборотистости двигателя дает не плохой прирост к максимальной скорости.

В третьем варианте, изменяется сразу и двигатель и коробка. Если двигатель почти не отличается от предыдущего, то коробка отличается принципиально — это четырех ступенчатый автомат. Не смотря на меньшее количество передач, суммарное передаточное число почти такое же (главная передача — 4,081, 4-я передача — 0,697), это дает не плохую расчетную максимальную скорость — 216,1 км/ч.. Напрашивается вопрос: «Почему автопроизводитель дает максимальную скорость практически идентичную первой комплектации?» Все дело в низком, по сравнению и механикой, КПД автоматической коробки.

На спидометре X-ray 200км/ч. хотя по паспорту только 172 км/ч.

На спидометре X-ray 200км/ч. хотя по паспорту только 172 км/ч.

Как видим, максимальная скорость является производной от основных параметров автомобиля, мощности двигателя, КПД узлов и агрегатов, передаточного числа трансмиссии. Если мощность параметр общедоступный, то КПД и особенности коробки, автопроизводитель обычно не хочет афишировать, поэтому дает косвенный показатель максимальной скорости.

Как итог:

Максимальная скорость — это важный параметр, который дает нам представление о КПД автомобиля, его экономичности и естественно возможностях на трассе, чем больше максимальная скорость, тем эффективнее будет его эксплуатация. Конечно не стоит ориентироваться только на этот параметр, нужно рассматривать все характеристики автомобиля комплексно.

Другие статьи на автомобильную тематику.

Какой двигатель (1.6 л.) Lada лучше? 21129 или h5MK?

Расслабьтесь, на Vesta и X-ray 1. 8 л. масложор не победить.

5 занимательных фактов о Lada Granta.

5 занимательных фактов о Lada Vesta.

5 занимательных фактов о Lada X-ray

Ускоренная визуализация сверхвысокого разрешения с помощью FRET-PAINT | Молекулярный мозг

Материалы

Модифицированные олигонуклеотиды ДНК были приобретены у Integrated DNA Technologies. Alexa488 (Alexa Fluor 488 NHS Ester, каталожный номер: A20000) был приобретен у Thermo Fisher Scientific. Cy3 (Cy3 NHS Ester, каталожный номер: PA13101) и Cy5 (Cy5 NHS Ester, каталожный номер: PA15101) были приобретены у GE Healthcare Life Sciences. Клетки COS-7 были приобретены в Korean Cell Line Bank. Антитело против тубулина (номер по каталогу: ab6160) было приобретено у Abcam.Антитело против Tom20 (sc-11415) было приобретено в Santa Cruz Biotechnology, Inc. Ослиное антитело против кроличьего IgG (каталожный номер: 711-005-152) и ослиное антитело против крысиного IgG (каталожный номер: 712-005-153). ) были приобретены в Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. Гранулы из карбоксилатекса (каталожный номер: C37281) были приобретены в Thermo Fisher Scientific. Док-нити конъюгировали со вторичными антителами с использованием набора для конъюгирования антитело-олигонуклеотид All-in-One (номер по каталогу: A-9202-001), приобретенного в Solulink.Параформальдегид (номер по каталогу: 1.04005.1000) был приобретен у Merck. Глутаральдегид (каталожный номер: G5882), Тритон X-100 (каталожный номер: T9284) и бычий сывороточный альбумин (каталожный номер: A4919) были приобретены у Sigma-Aldrich.

Мечение ДНК флуорофорами

Модифицированные амином олигонуклеотиды ДНК метили флуорофорами, которые имеют химическую группу сложного эфира NHS. 5 мкл 1 мМ ДНК смешивали с 25 мкл 100 мМ буфера тетрабората натрия (pH 8,5). Затем добавляли 5 мкл 20 мМ флуорофора в ДМСО.После тщательного перемешивания смесь инкубировали при 4 ° C в течение ночи в защищенном от света месте. Добавляли 265 мкл дистиллированной воды, 900 мкл этанола и 30 мкл 3 М ацетата натрия (pH 5,2) и тщательно перемешивали. Смесь инкубировали при -20 ° C в течение часа, а затем центрифугировали в течение пары часов, пока осадок ДНК не стал отчетливо виден. Супернатант удаляли, а осадок промывали холодным этанолом. После полного испарения этанола осадок ресуспендировали в 50 мкл дистиллированной воды и измеряли эффективность мечения.Если эффективность маркировки низкая, весь процесс маркировки повторяли.

Культивирование клеток, фиксация и иммуноокрашивание

Для коррекции дрейфа изображений DNA-PAINT стеклянные покровные стекла № 1.5 были редко покрыты шариками из карбоксилатекса. Покровное стекло покрывали раствором шариков 1:10, разведенным в дистиллированной воде, нагревали в течение 10 минут на горячей плите при 100 ° C, тщательно промывали дистиллированной водой и сушили газом N2. Клетки COS-7 выращивали на покровных стеклах, покрытых шариками, в течение нескольких дней, а затем фиксировали в течение 10 минут.2% глутарового альдегида в буфере цитоскелета использовали для визуализации микротрубочек (рис. 2), а смесь 3% параформальдегида и 0,1% глутарового альдегида в буфере PBS использовали для визуализации микротрубочек и митохондрий (рис. 3) [26, 27]. Фиксированные образцы хранили при 4 ° C в буфере PBS до тех пор, пока это не было необходимо. Канал для потока был создан путем сборки покровного стекла с ячейками и предметного стекла с использованием двусторонней ленты и эпоксидной смолы. В предметном стекле были предварительно сделаны два отверстия для удобной замены буфера.

Микротрубочки иммуноокрашивали путем инъекции разбавленных 1: 100 антител против тубулина в блокирующем растворе (5% бычий сывороточный альбумин и 0.25% Triton X-100 в буфере PBS) в канал и инкубируют при 4 ° C в течение ночи. После тщательной отмывки от свободных антитубулинов буфером PBS клетки инкубировали со 100 нМ вторичным антителом, конъюгированным с стыковочной цепью (Docking_P1, дополнительный файл 1) в течение 1 часа. Митохондрии иммуноокрашивали, вводя в канал разбавленное 1: 100 антитело против Tom20 в блокирующем растворе и инкубируя при 4 ° C в течение ночи. После тщательной отмывки свободного антитела против Tom20 буфером PBS клетки инкубировали со 100 нМ вторичным антителом, конъюгированным с стыковочной цепью (Docking_P2), в течение 1 часа.

Визуализация одиночных молекул

Для визуализации одиночных молекул использовались призменная флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения (TIRF) и микроскопия с наклонными и многослойными оптическими листами (HILO). Микроскоп был построен путем модификации коммерческого инвертированного микроскопа (IX71, Olympus) и оснащен масляно-иммерсионным объективом 100X 1,4 NA (UPlanSApo, Olympus). Для получения данных на рис. 1 стыковочные нити были иммобилизованы на покрытой полимером кварцевой поверхности предметного стекла с использованием взаимодействия стрептавидин-биотин, а донорные и акцепторные нити были добавлены в канал визуализации.Alexa488, Cy3 и Cy5 возбуждались синим лазером (473 нм, 100 мВт, MBL-III-473-100 мВт, CNI), зеленым лазером (532 нм, 50 мВт, Compass 215M-50, Coherent) и красный лазер (642 нм, 60 мВт, Excelsior-642-60, Spectra-Physics) соответственно. Сигнал Cy3 фильтровали с использованием дихроичного зеркала (640dcxr, Chroma), а сигнал Cy5 фильтровали с использованием дихроичного зеркала (740dcxr, Chroma). Изображения одиночных молекул записывали с частотой кадров 10 Гц с помощью камеры электронного умножителя с зарядовой связью (EMCCD) (iXon Ultra DU-897U-CS0- # BV, Андор).

Характеристика пар FRET

Для характеристики детектированных фотонов в кадре на рис. 1d, были собраны 13997 (8096), 11021 (5100), 11208 (3451) и 17051 (3980) одномолекулярные пятна для 2 нт, 4 нт. , 6 нуклеотидов и 11 нуклеотидов Cy3-Cy5 (Alexa488-Cy5) FRET пар соответственно. Для характеристики SNR на рис. 1j-k были собраны 795, 2322 и 742 одномолекулярных пятен для Cy3, пары Cy3-Cy5 и пары Alexa488-Cy5, соответственно.

Коррекция дрейфа

Для получения изображений сверхвысокого разрешения с помощью DNA-PAINT мы использовали самодельную систему автофокусировки и коррекции дрейфа, основанную на методе корреляции изображений.Перед съемкой были сделаны одно изображение в ярком поле в фокусе и два изображения не в фокусе. Эти три эталонных изображения использовались для отслеживания дрейфа осей x, y и z [28]. Дрейф в z-направлении корректировался в реальном времени с помощью пьезоэлемента (PZ-2000, Applied Scientific Instrumentation), тогда как дрейф в x-y плоскости корректировался во время анализа изображений.

Мультиплексная 3D-визуализация FRET в глубоких тканях живых эмбрионов

Эксперименты с визуализацией и обработка данных

Система FmFLIM-SLOT сочетает в себе измерение времени жизни FmFLIM с частотной разверткой при нескольких возбуждениях с объемной визуализацией SLOT (дополнительный рис.S3a).

Параллельные измерения канала Ex-Em с помощью FmFLIM

FmFLIM одновременно измеряет время жизни флуоресценции в частотной области на нескольких длинах волн возбуждения по принципу спектроскопии времени жизни флуоресценции с преобразованием Фурье 20,21 . Вместо того, чтобы разделять разные лазерные линии во времени путем включения и выключения лазеров, FmFLIM разделяет лазерные линии возбуждения, запечатывая уникальные частоты модуляции на каждой лазерной линии, так что лазерные линии с разными длинами волн можно различать в частотной области.

Импринтинг частоты осуществляется интерферометром Майкельсона с вращающимся многоугольным зеркалом (48 граней, 55 000 об / мин, диаметр 2,5 дюйма) оптическим рычагом задержки, который генерирует быстрое сканирование разницы оптических путей. Когда несколько лазеров возбуждения (на длинах волн 405, 488, 561 и 640 нм) модулируются интерферометром, каждая лазерная линия модулируется с уникальной мгновенной частотой, зависящей от длины волны f = v / λ, где v — скорость сканирования мгновенной оптической задержки интерферометра (дополнительный рис.S17). Когда модулированный многолинейный лазер используется для возбуждения флуоресцентного образца, фотоны флуоресценции, возбуждаемые определенной лазерной линией, отпечатываются с той же уникальной мгновенной частотой, что и лазер возбуждения, и сигналы фотонов, связанные с каждой линией возбуждения, могут быть считаны с помощью радиочастоты. (RF) понижающее микширование на серии совпадающих частот. Поскольку сигналы нескольких каналов возбуждения имеют разные частоты модуляции и не мешают друг другу во время понижающего РЧ-микширования, несколько каналов возбуждения могут быть активными и обнаруживаться одновременно с помощью принципа мультиплексирования Фурье (частоты модуляции).

В системе FmFLIM фотоны флуоресценции, возбуждаемые несколькими лазерными линиями, дополнительно разделяются по длинам волн излучения и обнаруживаются несколькими детекторами одновременно. Благодаря мультиплексированию возбуждения Фурье и нескольким каналам излучения система FmFLIM способна различать фотонные сигналы по спектральным свойствам возбуждения и излучения и обнаруживать все каналы возбуждения-излучения (Ex-Em) параллельно. Текущая система FmFLIM способна проводить одновременные измерения на 4 × 4 каналах Ex-Em (спектральная конфигурация показана на дополнительном рис.S3b), подходящий для большинства распространенных флуоресцентных белков и красителей в видимом диапазоне.

Многоканальные измерения времени жизни в FmFLIM

Время жизни флуоресценции каждого канала возбуждения-излучения измеряется методом времени жизни в частотной области. В дополнение к мультиплексированию Fourier Ex-Em, система FmFLIM также способна выполнять измерения срока службы в нескольких частотных точках в непрерывном диапазоне частот от 10 МГц до максимальной частоты 120–200 МГц в зависимости от длины волны лазера. Эта уникальная особенность обеспечивается оптической линией задержки на основе многоугольного зеркала в интерферометре, скорость развертки задержки которой изменяется линейно от -94 м / с до 94 м / с при частоте повторения 44 кГц. На выходе интерферометра лазерные линии модулируются в циклическую развертку по частоте с максимальными частотами в диапазоне от 120 до 200 МГц (что соответствует лазерной линии 640 нм и 405 нм, соответственно) в пределах 23 мкс (дополнительный рисунок S17). Модуляции с качающейся частотой на четырех лазерных линиях позволяют измерять время жизни флуоресценции в наносекундном диапазоне со скоростью 44 000 измерений в секунду.

Информация о времени жизни флуоресценции на всех каналах Ex-Em получается параллельно с помощью аналого-цифрового гибридного метода анализа данных, как описано ранее 21 (дополнительный рисунок S18). Короче говоря, для генерации сигнала измерения срока службы на заданных длинах волн Ex-Em (λ x , λ м ) комбинация фотонного сигнала от ФЭУ на длине волны излучения λ m и сигнала с фотодиода, который отслеживает частотную модуляцию лазерной линии λ x , отправляются на аналоговый радиочастотный смеситель (Mini-Circuits ZX05-1L-S +), после чего проходит фильтр нижних частот (Mini-Circuits BLP-10. 7+) (дополнительный рисунок S18b). Несущая частота результирующего сигнала понижается до 200 ~ 300 кГц. В ФЭУ с λ m фотонные сигналы, возбуждаемые лазерными линиями, отличными от λ x , удаляются в процессе микширования и фильтрации. Только сигнал, возбуждаемый лазерной линией λ x , участвует в понижающем смешанном сигнале, который содержит информацию о затухании флуоресценции

, где ω — мгновенная частота модуляции лазерной линии λ x , является РЧ-ответ характеристики электрических цепей в канале Ex-Em, — интенсивность сигнала, м, и ϕ — модуляция и фаза частотных характеристик времени жизни флуоресценции образца, а также несущая частота набора сигналов понижающего микширования гетеродинным понижающим микшированием.Сигналы понижающего микширования на нескольких каналах Ex-Em записываются одновременно с частотой дискретизации 2 МГц многоканальным высокоскоростным дигитайзером, оснащенным процессором сигналов FPGA (NI 5752 и 7962). Регистрируются 44 точки данных на канал на пиксель, чтобы охватить развертку по частоте в оба конца. Весь сбор данных, аппаратное управление и сканирование изображений выполняются с помощью специального программного обеспечения, написанного в LabVIEW (National Instruments).

Сложный РЧ-отклик системы детектирования, характеризуемый и, может быть предварительно откалиброван по стандартам времени жизни флуоресценции с известным временем однократного экспоненциального затухания,

, где H — преобразование Гильберта, м st и ϕ st — это модуляция и фазовые характеристики стандарта срока службы, рассчитанные на основе известного экспоненциального срока службы стандарта.Затем откалиброванный ВЧ-отклик системы может быть удален из частотной характеристики затухания образца

Частотный отклик затухания готов для анализа с помощью либо итерационной аппроксимации методом наименьших квадратов с соответствующими моделями срока службы, либо разработанного нами неитеративного комплексного подхода на основе векторов. для расчета срока службы в реальном времени 37 . Первый метод был использован для анализа всех результатов в этой статье. Последний метод, который может быть реализован в FPGA 37 , может позволить в будущем анализировать трехмерное изображение в реальном времени.

Объемное изображение с помощью SLOT

Чтобы получить трехмерную пространственную информацию об образце, FmFLIM, спектральное измерение, было объединено с SLOT, пространственным измерением. Таким образом, данные FmFLIM-SLOT сформировали 6-мерный объем, где x, z, θ — пространственные координаты сканирования томографической проекции.

Для выполнения FmFLIM-SLOT модулированный лазер с выхода интерферометра слабо фокусировался в пучок шириной 15 мкм с глубиной фокуса более 1 мм.Луч возбуждал флуорофоры вдоль линии лазерного пути по объему образца. Эмиссия вдоль пути луча собиралась и записывалась в виде одного пикселя на проекционном изображении (дополнительный рисунок S3). В этом исследовании общая мощность нескольких лазерных линий обычно составляла от 0,1 до 0,5 мВт. Из-за слабого фокуса луча интенсивность возбуждения была намного ниже, чем при конфокальной микроскопии, и у живых эмбрионов не наблюдалось ни фотообесцвечивания флуоресцентных белков, ни фототоксичности.Флуоресцентное излучение собирали под углом 90 градусов от линии лазерного возбуждения с помощью конденсорной линзы (диаметр 1 дюйм, f = 30 мм) и вогнутого зеркала (диаметр 2 дюйма, f = 25 мм). Полный телесный угол сбора флуоресценции составлял 1,32 ср, что эквивалентно углу сбора идеальной линзы с числовой апертурой 0,66. Коллимированные флуоресцентные излучения были разделены на несколько спектральных полос с помощью дихроичных зеркал и полосовых фильтров и обнаружены несколькими детекторами ФЭУ (Hamamatsu 7422). Излученный возбуждающий лазер собирался фотодиодным детектором для формирования пропускающей оптической проекции.

Чтобы получить данные проекции FmFLIM S ( x , z , θ; ω, λ x , λ м ) при угле проецирования θ, два гальванических зеркала сканировали сфокусированное лазерная линия поперек образца с размером пикселя 10 мкм и скоростью пикселя 44000 пикселей / сек. Образец поворачивали с шагом равного угла между каждым выступом. Обычно было получено 180 проекционных кадров с угловым шагом 2 градуса. Размер кадра 2D-проекции обычно составлял 200 × 350 пикселей (x на z), чтобы покрыть весь эмбрион рыбки данио.Полный набор данных проекции S ( x , z , θ; ω, λ x , λ м ) потребовал 12 минут сбора данных, из которых примерно 5 минут было потрачено на создание проекции изображения и остальное при вращении образца. В будущем запись данных и вращение образца можно будет выполнять одновременно за счет применения спиральной томографии, что позволит сократить время сбора вдвое. Набор данных 6-D проекции S ( x , z , θ; ω, λ x , λ м ) был обработан скриптами MatLab (MathWorks) для получения трехмерного мульти- изображения времени жизни флуоресценции канала.

Обработка данных FmFLIM-SLOT

Поскольку пространственные размеры ( x , z , θ) и временные / спектральные размеры (ω, λ x , λ м ) ортогональны, временная / спектральная и пространственная обработка не мешают друг другу. Аналогично одноканальной томографии FLIM 11,12 , данные FmFLIM-SLOT S ( x , z , θ; ω, λ x , λ м ) впервые подверглись реконструкция пространственной томографии и преобразована в S ( x , z , y ; ω, λ x , λ m ).Затем S ( x , z , y ; ω, λ x , λ м ) был подвергнут анализу срока службы по спектральным размерам (дополнительный рисунок S18b).

Реконструкция томографии требует известного центра вращения. Центр вращения предметного столика относительно проекционных изображений сначала был измерен с помощью фантома флуоресцентных шариков 40 перед визуализацией in vivo .

После восстановления томографии данные многоканального затухания реконструированных вокселей были скорректированы с учетом РЧ-ответа системы, как описано ранее, согласно уравнениям (1, 2, 3). Скорректированные данные о распаде были проанализированы с помощью итеративной аппроксимации методом наименьших квадратов с одноэкспоненциальной моделью времени жизни в частотной области, которая дала значения интенсивности I ( x , z , y ; λ x , λ m ). ) и средние времена жизни τ ( x , z , y ; λ x , λ м ) на нескольких каналах Ex-Em. Когда образец эмбриона содержал единственный датчик FRET, изображение времени жизни донорского канала служило индикатором эффективности FRET.Для визуализации с двумя датчиками FRET, в которых два датчика имели спектрально перекрывающиеся флуорофоры, использовался комбинированный метод анализа интенсивности-времени жизни для обработки трехканального изображения I ( x , z , y ; λ x , λ м ) объемов τ ( x , z , y ; λ x , λ м ) для получения индивидуальных показаний для каждого датчика FRET (дополнительные примечания ).

Визуализация трехмерных объемов жизненного цикла

Трехмерные объемные данные интенсивности и срока службы были визуализированы в двухмерные проекции для визуализации. Для проекций интенсивности трехмерные объемы всех спектральных каналов были преобразованы индивидуально в двухмерные проекции интенсивности с помощью метода проекции максимальной интенсивности (MIP), а затем объединены с двумерными проекциями интенсивности в псевдоцвете. 2D-проекции времени жизни были визуализированы из 3D-объемов интенсивности-времени жизни с помощью модифицированного алгоритма MIP, который рассчитывал проекции срока службы как средневзвешенные по интенсивности всех слоев и представлял среднее проекционное изображение в течение всего срока службы на шкале ложных цветов с интенсивностью MIP, отображаемой как яркость.

Вся реконструкция изображений, анализ данных и визуализация данных были выполнены с использованием собственного программного обеспечения, реализованного в MatLab (Mathworks Inc. ).

Процедуры для рыбок данио

Разведение и содержание рыбок данио

Рыбок данио ( Danio rerio ) выращивали и содержали в соответствии с описанием 41 . Для получения трансгенных рыбок данио использовали лабораторно инбредный штамм дикого типа AB *. Эмбрионы собирали после естественного нереста, выращивали при 28,5 ° C и стадировали в соответствии с часами после оплодотворения (hpf) до 10 hpf.Затем эмбрионы хранили при комнатной температуре для замедления развития и увеличения временного окна визуализации. Стадии развития эмбрионов оценивали по наблюдениям. Через 20 часов после оплодотворения эмбрионы переносили в среду для эмбрионов, содержащую 0,2 мМ 1-фенил-2-тиомочевину для предотвращения пигментации. Все процедуры на животных и экспериментальные процедуры были выполнены в соответствии с «Руководством по уходу и использованию лабораторных животных (8 th Edition)». Протокол использования животных был одобрен Университетским комитетом по использованию и уходу за животными Мичиганского университета (протокол № 4478).

Инъекция красителей для четырехцветных рыбок данио

Cy5-конъюгированный декстран 500 кДа (0,5 мг / мл) вводили подкожно в область заднего туловища 72 hpf трансгенному Tg ( enpep: GFP; pod: nfsB-mCherry ) личинки данио. После инъекции личинок окрашивали 100 мкМ Syto 41 (Life Technologies) в течение 30 минут 26 и трижды промывали зародышевой средой перед визуализацией.

Промотор клонирования и конструирование плазмид

Промоторы enpep были амплифицированы из геномной ДНК рыбок данио с помощью ПЦР и клонированы в вектор p5’E в наборе Tol2 gateway (великодушно предоставлен Drs.Чи-бин Чиен и Кристен Кван) 42 . Ген rtTA и промотор Tet-ON ( P Tight ) были амплифицированы из pRetroX-Tet-OnAdvanced и pRetroX-Tight-Pur (Clontech) и клонированы в pME и p5’E в наборе Tol2 gateway. соответственно. Датчик GEpacmC был щедрым подарком от доктора Киса Джалинка 43 . Сенсор кальция CD2V был получен от Addgene (плазмида № 37471).

Трансгенные конструкции были получены в соответствии с опубликованной процедурой для набора шлюзов Tol2 (http: // tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page).

Получение трансгенных рыбок данио и микроинъекция

Кепированная РНК, кодирующая транспозазу Tol2, была синтезирована из линеаризованной плазмиды с использованием набора для синтеза РНК mMessage mMachine T3 (Ambion) посредством in vitro транскрипции . Для создания трансгенных рыбок данио конструкцию ДНК вводили совместно с РНК, кодирующей транспозазу Tol2, в оплодотворенные яйца. Эмбрионы, экспрессирующие трансген, выращивали до зрелого возраста и скрещивали с рыбками данио дикого типа для получения трансгенных животных зародышевой линии.Экспрессию сенсора индуцировали обработкой 10 мкг / мл доксициклина (Sigma) в течение ночи. Поскольку доксициклин имеет сильную флуоресценцию при возбуждении 405 нм, эмбрионы замачивали и промывали в среде для эмбрионов в течение 30 минут перед визуализацией.

Генерирование тройных трансгенных рыбок данио с индуцибельной экспрессией сенсоров CD2V и GEpacmC

Трансгенная линия рыбок данио Tg ( enpep: rtTA; P Tight : CD2V ) была скрещена с трансгенной линией рыбок данио (). P Tight : GEpacmC ) для получения тройных трансгенных потомков с индуцибельной экспрессией сенсоров CD2V и GEpacmC в почечных канальцах.

Крепление рыбок данио

Эмбрионы рыбок данио монтировали в соответствии с протоколом установки многослойной трубки 44 , который оптимален для покадровой визуализации эмбрионов рыбок данио. Эмбрионы рыбок данио помещали в среду для эмбрионов, содержащую 200 мкг / мл трикаина и 0,1% агарозы с низкой температурой плавления (Sigma), а затем помещали в пластиковые пробирки FEP с внутренним диаметром 0,8 мм (Cole Parmer), заполненные 1% гелем агарозы. Показатель преломления пластика FEP соответствует показателю воды.

Лечение EGTA, BAPTA-AM и иономицином для рыбок данио

Эмбрионы рыбок данио обрабатывали в течение 2 часов смесью хелаторов кальция EGTA (Sigma, 3 мМ), BAPTA-AM (Sigma, 100 мкМ) и ионофором иономицином (Millipore, 10 мкМ), приготовленные на зародышевой среде.Время обработки 2 часа обеспечило полное проникновение препарата по всему эмбриону. Для визуализации после обработки эмбрионы рыбок данио помещали в лечебный раствор с добавлением 0,1% геля агарозы с низкой температурой плавления и 200 мкг / мл трикаина. Обработка снизила уровень Ca 2+ у эмбриона моложе 36 лет после оплодотворения. Эмбрионы рыбок данио были промыты и помещены обратно в обычную среду для эмбрионов после визуализации. В дальнейшем все эмбрионы развивались нормально.

Обработка форсколином и IBMX для рыбок данио

Эмбрионы рыбок данио обрабатывали в течение 2 часов смесью 100 мкМ активатора аденилатциклазы форсколина (Sigma) и 400 мкМ ингибитора фосфодиэстеразы IBMX (Sigma) в среде для эмбрионов. Для визуализации после обработки эмбрионы рыбок данио помещали в лечебный раствор с добавлением 0,1% геля агарозы с низкой температурой плавления и 200 мкг / мл трикаина. Лечение повысило уровень цАМФ в эмбрионе. Затем эмбрионы рыбок данио промывали и снова помещали в среду для эмбрионов. Все эмбрионы после обработки развивались нормально.

Репортеры на основе FRET для прямой визуализации изменений концентрации и распределения абсцизовой кислоты в Arabidopsis

1) Определите, способны ли трансгенные линии, экспрессирующие сенсоры, сообщать об эндогенных изменениях концентрации ABA.Этот эксперимент не является чрезмерно обременительным, поскольку трансгенные линии уже существуют, и, как отмечает рецензент, «обработка проростков маннитом может вызвать эндогенный синтез АБК и может быть использована в качестве быстрого / простого эксперимента, чтобы доказать, что датчики полезны для измерения изменений в эндогенных ABA контент ».

На основании недавних исследований, концентрация АБК в корнях и побегах увеличивается через несколько часов после стрессовых воздействий (Ikegami et al. , 2009; Geng et al., 2013).В более ранних исследованиях с использованием вручную препарированных замыкающих клеток измерялось увеличение концентрации АБК в замыкающих клетках через 15 минут после пассивного обезвоживания листьев (Harris and Outlaw, 1991). ABAleon2.1 обнаружил увеличение эндогенной концентрации ABA в замыкающих клетках через 15 минут после падения влажности (рис. 9A, B) и через 4 часа после обработки 100 мМ NaCl (рис. 9C, D). Интересно, что 4 часа обработки 300 мМ сорбита не вызвали увеличения АБК в замыкающих клетках (рис. 9C, D). Когда пятидневные проростки обрабатывали в течение 6 часов, как NaCl, так и сорбитол вызывали повышение концентрации АБК в корнях (рис. 9E-H).Эти эксперименты теперь описаны и обсуждаются в рукописи (Аннотация; Результаты; третий абзац раздела «Обсуждение», озаглавленного «Анализ изменений концентрации АБК и переноса АБК на большие расстояния у Arabidopsis»).

2) Определите, проявляют ли трансгенные линии, экспрессирующие сенсоры, измененную чувствительность к экзогенной АБК. Поскольку сенсоры связываются с ABA и, возможно, с другими эндогенными белками, необходимыми для передачи сигнала ABA, возникает вопрос о том, проявляют ли растения, экспрессирующие сенсоры, измененную чувствительность к ABA.Опять же, этот эксперимент не слишком обременительный; например, можно использовать простые анализы ингибирования роста. Как отмечает рецензент, «я не думаю, что линии должны иметь 100% чувствительность ABA дикого типа, чтобы быть полезными. Было бы идеально, если бы это было так, но ключевым моментом является знание присущих им свойств и ограничений, а также предостережений, которые возникают вместе с при их использовании ».

Мы благодарим рецензентов за предложение этих экспериментов. Фенотипические анализы были выполнены с двумя ABAleon2.1 (строка 3 и строка 10), которые выражают ABAleon2.1 на разных уровнях (рисунок 5A). Эти линии сравнивали с линиями сверхэкспрессии Col-0 дикого типа, YFP-PYR1 и abi1-3 / YFP-ABI1 (Nishimura et al. , 2010) в анализах чувствительности ABA (рис. 5). В тестах на закрытие устьиц, индуцированных АБК, обе линии ABAleon2.1 проявляли ответы на АБК, которые были сопоставимы с растениями дикого типа Col-0 (фиг. 5J). Однако обе линии ABAleon2.1 показали пониженную чувствительность к ABA в анализах прорастания семян, разрастания семядолей и роста проростков (рис. 5B-I).Интересно, что степень чувствительности ABA в обеих линиях коррелировала с уровнями экспрессии ABAleon2.1, которые были определены с помощью количественной флуоресцентной микроскопии (рис. 5A). По сравнению с abi1-3 / YFP-ABI1, чувствительность ABA растений ABAleon2.1 была аналогичной в анализах роста проростков (Рисунок 5D, E, I), но меньше влияла на тесты прорастания семян и увеличения семядолей (Рисунок 5B, C, FH). Более высокая интенсивность флуоресценции обеих линий ABAleon2.1 по сравнению с abi1-3 / YFP-ABI1 указывает на то, что ABAleon2.1 гораздо более выражен, чем YFP-ABI1. На основании того, что ABAleon2. 1 не проявляет активности фосфатазы in vitro (Рисунок 1H) и что степень чувствительности ABA коррелирует с уровнями экспрессии ABAleon2.1, может возникнуть снижение чувствительности ABAleon2.1 растений (Рисунок 5). от ABAleon2.1 опосредованное удаление физиологически значимых концентраций ABA в определенных тканях. Мы считаем, что у любого метода есть свои ограничения, и что их полезно проанализировать, как сейчас, в этом исследовании.Актуальность, ограничение и возможный механизм снижения чувствительности ABAleon2.1 к АБК теперь описаны и обсуждаются в рукописи (Аннотация; раздел результатов, озаглавленный «Растения Arabidopsis, экспрессирующие ABAleon2.1, являются гипочувствительными к АБК; последний абзац раздела обсуждения, озаглавленный« Дизайн ABAleon ») репортеры »).

Хотя мы не обменивались рукописями с лабораторией Фроммера, краткие сообщения информируют нас о том, что их репортеры сконструированы по-другому, имеют другой динамический диапазон и дополнительный диапазон определения концентрации ABA. Основываясь на этих различиях, два класса репортеров ABA, разработанные и проанализированные в наших соответствующих лабораториях, могут использоваться для различных аспектов биологии ABA и могут дополнять друг друга.

Прочие выпуски:

3) Авторы показывают очень четкую кривую титрования чувствительности к pH, показывающую независимость сенсора от pH при pH выше 7,0. Некоторое обсуждение ожидаемых изменений pH в ответ на ABA было бы полезно для рассмотрения этой зависимости pH в контексте полезности датчика .

Известно, что

ABA вызывает защелачивание цитоплазмы замыкающих клеток. Теперь мы обсудим предыдущую литературу, показывающую это, и обсудим стабильность ABAleon в этом диапазоне pH, как предлагается (пятый абзац раздела «Обсуждение», озаглавленный «Анализ изменений концентрации ABA и переноса ABA на большие расстояния у Arabidopsis»).

4) В Рис. 3A похоже, что сигнал как акцептора FRET, так и сигнала донора увеличивается после добавления ABA в защитную ячейку. Можно ожидать, что сигнал донора будет расти, а сигнал акцептора падать по мере увеличения уровня АБК.Означает ли это, что за период эксперимента произошел значительный синтез датчика?

Исследование данных изображений показало, что увеличение эмиссии акцепторов в анализах замыкающих ячеек на рис. 3A-C было вызвано небольшим смещением образца. Хотя известно, что ABA индуцирует экспрессию определенных PP2C и подавляет экспрессию определенных PYR / PYL / RCAR (Leonhardt et al., 2004; Santiago et al., 2009; Szostkiewicz et al., 2010), зависимая от ABA экспрессия ABAleon2 .1 маловероятно. ABAleon2.1 экспрессировался под контролем промотора pUBQ10, который не зависит от ABA (http://bar.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgi; Winter et al., 2007). Не ожидается, что существенные изменения в уровнях белка ABAleon2.1 произойдут в течение периода времени экспериментов, показанных на рисунке 3. В случае синтеза белка de novo , вновь синтезированные белки ABAleon2.1 не повлияют на логометрические измерения в временные рамки экспериментов на рисунке 3, поскольку время созревания mTurquoise составляет> 1 час (Goedhart et al. , 2010). Мы добавили текст к подписи к рисунку, отметив, что небольшой дрейф образца способствовал сигналам флуоресценции на рисунке 3A.

5) Существует довольно много работ, в которых пытались оценить уровни АБК в отдельных типах клеток, например, в рукописи из лаборатории Вейлера были сделаны оценки замыкающих клеток после стресса ( Harris et al. 1988 ). Я думаю, что более раннюю литературу по этой теме следует процитировать и обсудить во Введении и Обсуждении .

Спасибо за этот комментарий. Этот раздел был включен во Введение: «В ответ на ограничение воды концентрация ABA увеличивается (Harris et al., 1988; Harris and Outlaw, 1991; Christmann et al., 2007; Forcat et al., 2008; Ikegami et al. , 2009; Geng et al., 2013) и уменьшаются при снятии стресса (Harris, Outlaw, 1991; Endo et al., 2008) ».

Этот раздел был включен в Обсуждение: «В замыкающих клетках Vicia faba концентрации ABA были ∼ 0.7 фг / пара клеток в нестрессированных и ~ 17,7 фг / клеточная пара в стрессовых замыкающих клетках (Harris et al. , 1988). По оценкам, концентрации АБК в замыкающих клетках, подвергнутых стрессу, находятся в диапазоне ~ 15 мкМ (Harris et al., 1988; Harris and Outlaw 1991). Экстраполируя эти значения, концентрация АБК в ненапряженных замыкающих клетках будет составлять ~ 500 нМ. Такие приближения будут согласовываться с частичным насыщением и сниженным ответом ABAleon2.1 в замыкающих клетках (Рисунок 3A-C) и с сильной экспрессией ABA-индуцированного репортера pRAB18-GFP (Рисунок 2 – рисунок в приложении 1).”

В дополнение к запрошенным пунктам мы включили новый рисунок (Рисунок 8), на котором АБК-индуцированные ответы низкоаффинных АБАлеонов (ABAleon2.13, ABAleon2.14 и ABAleon2.15) были исследованы в зоне созревания корней. трансгенных растений Arabidopsis. Эти анализы демонстрируют полезность ABAleon2.15 (K ‘ d ∼ 600 нМ), который может дополнять ABAleon2.1 с высоким сродством (K’ d ∼ 100 нМ) (раздел результатов, озаглавленный «Отчеты о низком сродстве ABAleon2.15» Поглощение АБК корнями »).

https://doi.org/10.7554/eLife.01739.023

Обеспокоитесь коронавирусом, если хотите, но перспектива необходима

Мы не знаем, что делать с коронавирусом, из-за которого мы попадаем в довольно большую лодку. По крайней мере, это не круизный лайнер.

Совершенно очевидно, что этот супергрипп потенциально смертельный, особенно для пожилых людей; он быстро распространяется по миру; и люди обеспокоены, но, возможно, больше, чем того заслуживает угроза. Проблема, как и почти во всем, заключается в том, что вирус политизируется, и президент Трамп видит в нем гораздо большую угрозу своему переизбранию, чем Берни или Байден, а демократы также видят в этом свой лучший шанс на переизбрание. избавьтесь от этого президента, которого они ненавидят.

Результат: массу дезинформации навязывают общественности — обеими сторонами.

Очевидным последствием стал фондовый рынок в частности и экономика в целом. Коронавирус парализовал торговлю, и рябь превратится в волны. Те, кто достаточно взрослые, вспомнят 2008 год, когда они наблюдали, как их портфели акций и планы 401 (k) пошли в свободное падение, посеяв страх и неуверенность по мере того, как исчезли сбережения и пенсии людей.Рынок, как всегда, восстановился и всего несколько недель назад был на рекордно высоком уровне. Наш совет прост: просто посмотрите в другую сторону и не подвергайте себя повседневным взлетам и падениям рынка.

Если вы думали, что экономика стабильна месяц назад, то сегодня у вас нет оснований полагать иначе; его основы не изменились. Однако есть вероятность, что впервые с 2009 года ВВП может оказаться в минусе в течение квартала.

Однако сейчас смертность намного важнее денег, и задача у всех одинакова: принимать разумные меры предосторожности против заражения вирусом.Вы знаете, что делать.

— Продолжайте мыть руки, и это нормально. Не мойте машину проезжая мимо. Мыло и вода, возможно, спирт, и продолжайте умываться, пока поете себе песню. Мы рекомендуем не «Лестницу в небеса», а длительный скраб.

— По возможности минимизируйте близкие контакты с другими людьми, особенно с теми, кто подвержен повышенному риску. Избегайте толп. Тусоваться в доме. И пока вы дома, хорошо помойте его.

— Не будь героем: если ты думаешь, что заболел, не ходи на работу.Изолируйте себя.

Когда это было написано, вирус достиг 33 штатов, включая Северную Каролину, с более чем 400 зарегистрированными случаями, и произошла эскалация профилактических мер, таких как ограничения на поездки и отмена мероприятий, таких как спортивные состязания, где много людей втиснутся в небольшое пространство.

Пока, и удар по дереву, вирус не достиг округа Робсон, который, как и другие сельские округа, немного изолирован нашей демографией. Как отметил Билл Смит, директор департамента здравоохранения округа Робсон, были и предыдущие вспышки — на ум приходят SARS, MERS, Зика и Эбола, — которые вызвали страх, но мы думаем, что коронавирусу удалось поднять планку.Ни одна из этих инфекций не достигла графства Робсон, и мы можем только надеяться, что нам снова повезло.

Однако мы не можем рассчитывать на это.

Мы рекомендуем держать угрозу в перспективе, которая наиболее реальна для людей в возрасте 70, даже 80 лет и старше. Несмотря на то, что уровень смертности в 3,4% упоминался, это относится к известным случаям, а поскольку симптомы иногда бывают очень легкими, неизвестно, сколько случаев остается недиагностированным. Появляется все больше свидетельств того, что реальный уровень смертности на самом деле составляет менее 1%.

Это, если подсчитать вероятность заражения болезнью, невероятно увеличивает шансы на худшее для вас или для вас. Если нужно, волнуйтесь, но мы настоятельно просим вас утешиться этими фактами — при этом соблюдая меры предосторожности.

Есть ли гидроусилитель на ладу гранта. Все об установке электроусилителя на лад гранту в гараже

Установка ЭУР на Granta Standard — частая причина обращений владельцев данных автомобилей в автосервис.Однако при должном навыке вы легко сможете сделать это самостоятельно. Как установить такую ​​систему, если у вас есть Lada Granta и стоит ли вообще это делать — читайте в статье.

[Скрыть]

Стоит ли устанавливать электроусилитель руля

Езда без гидроусилителя, конечно, возможна. Однако, если вы ранее управляли автомобилем, оснащенным такой системой, вы можете испытать серьезный дискомфорт. Вы лишитесь привычной опоры электродвигателя.

Установка такого механизма сложна и дорога. Но все они окупятся комфортом и повышенной безопасностью для вас и ваших пассажиров.

Итак, ответ на вопрос «Стоит ли устанавливать?» — это однозначное «да». Даже если вы не хотите делать это самостоятельно, обратитесь в автосервис.

В видео ниже вы найдете сравнение преимуществ гидроусилителя руля и ЭУР (автор видео — AUTOTEMA TV).

Возможные неисправности ЭУР

Бывает так, что после установки ЭУР вообще не работает или с перебоями.

Это может быть вызвано разными причинами, среди которых чаще всего выделяются две:

  1. Поломка датчика скорости. в связи с датчиком скорости. На высокой скорости дополнительное усилие от механизма уменьшается, чтобы дать вам больше контроля. Если данные с датчика перестанут поступать, ЭУР автоматически отключится. Проблема решается заменой датчика.
  2. Неправильно установлен блок-картер. При нарушениях в установке картера (картера) двигателя колебания от двигателя будут передаваться на усилитель.Он начнет гудеть, в некоторых случаях даже выключится.

Инструкции по установке


Это руководство предназначено для тех, кто имеет минимальный опыт работы с автомобильными инструментами и системами. Он сделан максимально доступным для всех. Но если вы сомневаетесь в своих навыках и знаниях, лучше обратиться в автосервис.

Необходимые инструменты и материалы

В первую очередь вам понадобится сам ЭУР. Обратите внимание на его серийный номер … Две последние цифры указывают на тип и место производства.

Итак, 00 — усилитель коробки передач, производства Махачкалы, имеет претензии со стороны водителей. С номерами 04 — корейский, поставил на Гранту и Калину, хороший усилитель, в магазинах можно найти, а на развалинах не так уж много. Ну и 02 — калужский, безредукторного типа, тоже отзывы хорошие.

Для подключения понадобятся такие обычные инструменты, как отвертки, гаечные ключи, болгарка.

Процесс установки

Сначала вам нужно будет полностью снять такие предметы, как подушка, рулевое колесо, переключатели, замок зажигания, а также конец рулевой колонки вместе с кронштейном и карданом.

  1. Взяв старую скобу-пластину, выбиваем из нее болты. Затем отрежьте примерно 30 мм от верха (где приварены 2 болта и есть 3 отверстия).
  2. Примерьте пластину для ЭУР, если отверстия не совпадают (скорее всего будут) просверлите их.
  3. Теперь нужно прикрепить стабилизатор к усилителю.
  4. Шайбы следует поставить под кронштейн в месте крепления к усилителю. Они бывают разной толщины и напрямую влияют на будущую регулировку рулевого управления.
  5. Теперь можно исправить евро. Вставляем кардан в рейку.

После всего этого нужно подключить проводку. Ниже представлена ​​схема подключения.


Регулировка рулевого колеса

Как упоминалось выше, шайбы играют роль в том, насколько рулевая колонка будет отклоняться вверх и вниз. Устанавливаются между кронштейном и усилителем. Величина прогиба рулевой колонки зависит от их толщины.

Видео «Установка электроусилителя руля»

В этом видео рассказывается о плюсах и минусах такой системы, а также подробно демонстрируется процесс установки (автор видео — sokur64).

Руль

Гранта и ВАЗ 2114 — важный элемент управления автомобилем. самые распространенные в этой системе? Какие есть способы обновить узел? Прежде чем отвечать на эти вопросы, нужно четко понимать, что рулит.

На сегодняшний день две новейшие разработки отечественного предприятия и ВАЗ 2114 являются безоговорочными лидерами на российском рынке … Оригинальные, стильные, мощные, эти автомобили заслуживают особого внимания и положительной оценки. Собранные по новой технике Гранта и ВАЗ 2114 вызвали широкий интерес у автомобилистов.Но, конечно же, любая, даже самая лучшая разработка имеет свои недостатки, о которых должен знать владелец, чтобы не возникало проблем при эксплуатации. В частности, рулевое управление может преподнести множество сюрпризов.

Функции рулевого управления

Рулевое управление — это система, приводящая в движение автомобиль … Она состоит из рулевого колеса, стойки, механизма и привода. Принцип работы рулевого колеса основан на том, что колесо получает импульс силы водителя и передает его механизму, который реагирует в соответствии с направлением, заданным водителем.То есть, когда водитель поворачивает руль, он передает крутящую силу на механизмы, которые связаны с передними колесами, так происходит движение.

Устройство рулевого механизма Лада Гранта

Рулевое колесо легкового автомобиля отличается от рулевого колеса грузового автомобиля прежде всего диаметром. В первом случае это 390-420 мм, во втором — 445-545 мм. У спорткаров руль меньше стандартного, установлен на обычном легковом автомобиле… Помимо диаметра, есть разница в механизме управления.

Сегодня существует несколько типов рулевых колонок, от обычных и недорогих до таких, которые позволяют ей складываться при фронтальном ударе в высокой степени. Кроме того, рулевые колонки имеют как механическую, так и электрическую регулировку, что очень удобно, когда нужно отрегулировать высоту руля или его направление.

В принадлежащих образцам последних лет присутствует рулевая колонка, которую легко переставить с места водителя на место правого пассажира.Рулевой механизм — устройство, передающее колебания от силы воздействия на рулевую колонку на привод.

Существует несколько типов рулевого механизма, наиболее распространенным из которых является реечная передача.

Также встречается в российских моделях Lada Kalina, Grant, ВАЗ 2114 и других проектах АвтоВАЗа. А вот легендарные БМВ, Тойота, Мазда и другие оснащаются более сложным рулевым механизмом, с принципом действия на все четыре колеса. Это решение гарантирует отличную устойчивость и отличную управляемость.

Привод передает усилие от рулевого механизма на колеса. Сегодня известно несколько конструкций приводов, в зависимости от того, какая из них. Самым популярным и известным является механический привод, который состоит из шарниров и тяг. Этот тип строительства встречается как в российских моделях, таких как Grants, так и в европейских проектах.

Типы рулевого управления с гидроусилителем

Тип конструкции рулевого управления с гидроусилителем

Для повышения эффективности и комфорта рулевого управления применяется усилие.Механизмы делятся на три типа:

Электроусилитель руля приводится в действие электричеством и имеет довольно сложную конструкцию. ЭУР значительно улучшает динамику, маневренность, управляемость автомобиля, в некоторых случаях даже позволяет. Электроусилитель руля сегодня имеется не только в иномарках, как было десять лет назад, но даже в отечественных моделях, например. Купить его можно в любом автомагазине страны.

Принцип работы гидроусилителя руля заключается в перекачивании гидравлической жидкости… Усилитель мощности обладает хорошей способностью смягчать удары, падающие на рулевое колесо при движении на высокой скорости по неровной дороге. Механизм также улучшает маневренность. Он может уступать только электрическому усилителю только в том, что он не экономичен, а более эффективен и надежен. Пневмоусилитель — современная версия, пока еще редко встречающаяся в автомобилях и тем более не встречающаяся в отечественных проектах, хотя уже сейчас ее можно купить в крупных автосалонах. Рулевое управление

Особенности Гранта

Рулевое колесо от Гранты — стандартное, реечного типа, привод состоит из двух рулевых тяг, объединенных в единую конструкцию за счет шаровых опор.В теории неплохо, но практика показывает обратное. Отверстия для рулевых тяг невероятно огромны, что хорошо для воздухообмена, но плохо для загрязнения. Удивительно, но такие практические мастера АвтоВАЗа как-то раньше не задумывались над этой насущной проблемой. Чтобы исправить этот недостаток, многие автовладельцы устанавливают простые втулки рулевых тяг Lada.

Чаще всего руль от Гранты страдает ослаблением крепления. Что делать в этом случае? Вам просто нужно сильнее затянуть гайки.Также можно отметить возникновение стуков на рулевом колесе. Чтобы устранить проблему, стоит подтянуть гайки, если они ослаблены, или заменить детали, если при осмотре вы обнаружите, что они изношены. При крутом повороте руля Лада Гранта придется менять подшипник. В некоторых случаях необходимо отремонтировать стойку подвески и смазать детали.

Фото и видеообзор салона автомобиля Лада Гранта.
Что такое максималка Lada Granta luxury?
Как снизить расход топлива автомобиля Лада Гранта

Установка EUR на Granta Standard — частый повод для владельцев этих автомобилей обращаться в автосервис.Однако при должном навыке вы легко сможете сделать это самостоятельно. Как установить такую ​​систему, если у вас есть Lada Granta и стоит ли вообще это делать — читайте в статье.

Стоит ли устанавливать электроусилитель руля

Езда без гидроусилителя, конечно, возможна. Однако, если вы ранее управляли автомобилем, оснащенным такой системой, вы можете испытать серьезный дискомфорт. Вы лишитесь привычной опоры электродвигателя.

Установка такого механизма сложна и дорога.Но все они окупятся комфортом и повышенной безопасностью для вас и ваших пассажиров.

Итак, ответ на вопрос «Стоит ли устанавливать?» — это однозначное «да». Даже если вы не хотите делать это самостоятельно, обратитесь в автосервис.

В видео ниже вы найдете сравнение преимуществ гидроусилителя руля и ЭУР (автор видео — AUTOTEMA TV).

Возможные неисправности EUR

Бывает, что после установки ЭУР вообще не работает или с перебоями.

Это может быть вызвано разными причинами, среди которых чаще всего выделяют две:

  1. Обрыв датчика скорости. Электроусилитель руля работает в связке с датчиком скорости. На высоких скоростях дополнительное усилие от механизма уменьшается, чтобы дать вам больше контроля. Если данные с датчика перестанут поступать, ЭУР автоматически отключится. Проблема решается заменой датчика.
  2. Неправильно установлен картер. При нарушениях в установке картера (картера) двигателя колебания от двигателя будут передаваться на усилитель.Он начнет гудеть, в некоторых случаях даже выключится.

Инструкция по установке

Это руководство предназначено для тех, кто имеет минимальный опыт работы с автомобильными инструментами и системами. Он сделан максимально доступным для всех. Но если вы сомневаетесь в своих навыках и знаниях, лучше обратиться в автосервис.

Необходимые инструменты и материалы

Прежде всего, вам нужен сам евро. Обратите внимание на его серийный номер. Последние две цифры указывают на вид и место производства.

Итак, 00 — усилитель коробки передач, производства Махачкалы, есть претензии со стороны водителей. С номерами 04 — корейский, поставил на Гранту и Калину, хороший усилитель, в магазинах можно найти, а на развалинах маловато. Ну и 02 — калужский, безредукторного типа, тоже отзывы хорошие.

Для подключения понадобятся такие обычные инструменты, как отвертка, гаечный ключ, болгарка.

Процесс установки

Сначала нужно будет полностью снять такие предметы, как подушка, рулевое колесо, переключатели, замок зажигания, а также конец рулевой колонки вместе с кронштейном и карданом.

  1. Взяв старую скобу-пластину, выбиваем из нее болты. Затем отрежьте примерно 30 мм от верха (где приварены 2 болта и есть 3 отверстия).
  2. Примерьте пластину для ЭУР, если отверстия не совпадают (скорее всего будут) просверлите их.
  3. Теперь нужно прикрепить стабилизатор к усилителю.
  4. Шайбы должны быть размещены под кронштейном в месте крепления к усилителю. Они бывают разной толщины и напрямую влияют на будущую регулировку рулевого управления.
  5. Теперь можно исправить EUR. Вставляем кардан в рейку.

После всего этого нужно подключить проводку. Ниже представлена ​​схема подключения.

Схема подключения

Регулировка рулевого колеса

Как упоминалось выше, шайбы играют роль в том, насколько рулевая колонка будет отклоняться вверх и вниз. Устанавливаются между кронштейном и усилителем. Величина прогиба рулевой колонки зависит от их толщины.

Видео «Установка электроусилителя руля»

В этом видео рассказывается о плюсах и минусах такой системы, а также подробно демонстрируется процесс установки (автор видео — sokur64).

Комментарии и отзывы

Баранов Иван Иванович

Стаж работы на СТО:

Просмотреть все ответы

Avtozam.com Ваш помощник в ремонте и обслуживании автомобилей

Использование вами этого веб-сайта означает ваше согласие с тем, что вы используете его на свой страх и риск.

Система рулевого управления автомобиля ВАЗ 2114 с самого начала предполагала возможность установки гидроусилителя руля с помощью установочного комплекта… Это касается и электроусилителя руля или просто ЭУР.

Данная модификация позволит упростить поворот автомобиля и повысить комфорт вождения. Это особенно актуально для водителей, которые большую часть времени ездят по городу.

Основное отличие гидроусилителя руля (ГУР) от ЭУР в том, что сила (КПД) первого напрямую зависит от скорости вращения мотора. На высокой скорости рулевое колесо слишком легко повернуть. Это влияет как на ощущение езды, так и на управляемость.

Чтобы преодолеть такие проблемы, усилитель рулевого управления не подключен напрямую к двигателю, а с помощью регулятора усиления. Именно такой функциональностью обладает электрический усилитель. Работа ЭУР не характеризуется прямой зависимостью между усилием и мощностью мотора, что позволяет включать его в работу по мере необходимости в конкретной ситуации.

Для ВАЗ 2114 подойдет аналогичный ЭУР, как на Лада Приора.

Дополнительные преимущества использования электроусилителя вместо гидроусилителя руля:

  • Меньше требований к техническому обслуживанию (нет необходимости отслеживать масло, соединения).
  • В холодную погоду греться не нужно, как при использовании гидроусилителя руля.
  • Установить ЭУР намного проще (не нужно будет мешать моторному отсеку).
  • Высокая надежность.
  • Единственный минус — меньшая мощность, хотя у легковых автомобилей вроде ВАЗ 2114 это совершенно не заметно.

Ответ уникален для каждого автолюбителя. С одной стороны, рулевое управление становится легким, и эффект действительно заметен.С другой стороны, помимо финансовой стороны вопроса (а это не менее 15-20 тысяч рублей) на его установку потребуется потратить целый день. Выбор полностью за вами, но если вы все же решитесь, мы поможем вам с установкой.

  1. Сам электроусилитель;
  2. Блок управления;
  3. Промвал;
  4. Электропроводка.

При установке электроусилителя необходимо учитывать, что потребуется замена рулевой колонки ВАЗ 2114 на «электрическую колонку».Для этого начнем с разводки. Вам нужно будет разобраться с подушечками. Никаких «скручиваний» не понадобится. В колодке есть клемма, которую нам нужно снять и вставить в колодку в жгуте.

Вставляем свободный вывод жгута ровно на то место, где был штатный провод. Специального жгута для этого не нужно. Подключите два 4-х квадратика к аккумулятору. Не забудьте подключить предохранитель на 50А. «Слабо» подключится к тахометру, датчику скорости, массе, K-линии и проводке на контрольной лампе. Не забудьте проверить сигналы спидометра и тахометра.

  1. Снимите крышку с переключателями и замком зажигания.
  2. Открутите болт на рейке и снимите его. Надо определить, насколько «родная» часть больше нашей новой.
  3. Устанавливаем вал на ЭУР. После этого прикрепляем вал на место.
  4. Настраиваем проводку. Продеваем два кабеля к АКБ из салона, желательно через левое крыло.Опубликовать вы можете:
  • Сначала снимите бачок омывающей жидкости.
  • Возьмите жесткий провод и протащите его, пытаясь добраться до капота.
  • Как только он появляется на капоте, прикрепляем к нему наши провода.
  • Вытаскиваем вместе с нашей проволокой.
  1. Подключаем электронику ЭУР. Под панелью приборов красный блок, а в нем оранжевый провод. Именно к нему нужно подключить электрический усилитель.
  2. Аналогичные действия необходимо проделать с серым проводом.
  3. Соединяем силовые концы. Подключаем к аккумулятору розовый, это плюс, а черный — минус.

На этом установка завершена. Если вы сделали все аккуратно по инструкции, вы получите удовольствие от легкости вождения ВАЗ 2114.

Если вам не нравится высота и положение руля, то вам нужно будет отшлифовать края лопастей до нужного вам размера или установить проставки между пластиной и корпусом.Стоит помнить, что электроусилитель руля автоматически отключается на скорости выше 50 км / ч, в отличие от того же гидроусилителя руля.

Установить электроусилитель руля своими руками вполне реально. Стоит только помнить, что даже с опытным водителем это займет много времени и сил. Но для любителя комфортной езды результат оправдает все затраты и ожидания.

ЧТО ТАКОЕ ПОД ПАНЕЛЬЮ?

Гнездо под панелью — разъем для подключения проводов.

В магазине мне предложили купить евро от калины. Приоры не было. Итак, какой купить?

На ваз 2114 какой установить электрический уселитель? От приоры или от калины.

Ставка от приоры.

Покупал от приоры, так как не факт что калина сядет без проблем.

с какой машины можно поставить сиденье на ваз2114

от Приора, Гранта, от Рекаро

Добрый день. Подскажите пожалуйста ситуацию следующая ВАЗ 2114 1.6. 8 кл. Двигатель не запустится, пока не будет нажата педаль акселератора. В 3 мастерских все выглядело нормально, мол еще никого не видели. Электронная педаль. Пробег 14 тыс. Спасибо.

Здравствуйте! У меня такая проблема, купил машину, ВАЗ 2115, с уже установленным электроусилителем … В последнее время начал давать сбой (иногда не включается при запуске, перезагрузка машинка начинает работать), вот и да вообще не включается. Подскажите пожалуйста, каковы причины и меры по их устранению?

Обрыв проводки или неисправный двигатель.

привет. подскажите почему не гаснет светодиод в ключе зажигания на ваз 2114, даже если ключ вытащен.

ДОБРЫЙ ДЕНЬ КУПИЛ ЕВРО У ПРИОРА СЕЙЧАС ХОЧУ УСТАНОВИТЬ НА ВАЗ 2114. ПРОДВИГАЙТЕ ГДЕ КУПИТЬ РАЗЪЕМ ПРОВОДОВ И ТАБЛИЧКУ С КАРДАНКОЙ. НАПИШИТЕ, ПОЖАЛУЙСТА,

Автомобили ВАЗ 2110 оснащены электроусилителем руля, что безумно радует водителей. Это дополнение значительно улучшает маневренность и управляемость автомобиля, что позволяет водителю чувствовать себя более уверенно на дороге.

Кроме того, водителю не нужно прикладывать много усилий к рулевому колесу, что позволяет совершать длительные поездки, не чувствуя усталости.

Электроусилитель руля на автомобили ВАЗ 2110 при необходимости можно установить самостоятельно, но для этого нужно разбираться в устройстве.

Еще в 2002 году инженеры Новосибирского технического университета разработали этот ставший столь популярным электроусилитель руля. После того, как были пройдены все этапы создания устройства, в течение нескольких лет устройство проходило испытания на заводе ВАЗ.

Российских производителей сделали все, чтобы обеспечить надежное и качественное преимущество агрегата перед аналогичными приборами зарубежного производства. В усилителе используется переменный ток для обеспечения надежности и долговечности.

Схема электроусилителя Приора

Но главным для наших драйверов была приемлемая стоимость этого блока, намного ниже, чем у западных комплектующих. Кроме того, электроусилитель может стать надежным защитником от кражи. Поскольку электрические усилители были изобретены для отечественных марок, их производят, соответственно, в России, на Бердском электромеханическом заводе, ставшем дочерним предприятием ВАЗа.

Сам электроусилитель руля впервые был изобретен и внедрен еще в 1990 году в Японии на заводах концерна Toyota. Первые достоинства устройства, которые он продемонстрировал, характеризовались следующими показателями:

  • Агрегат работает даже при выключенном двигателе;
  • Во время работы компонентов может наблюдаться значительная экономия топлива в течение определенного периода времени;
  • Значительно улучшены все показатели управляемости;
  • Надежность управления достигает больших высот;
  • Создает хорошие условия безопасности при постоянной езде.

Необходимо понимать, что гидроусилитель руля — это гидроусилитель руля и эти два устройства постоянно сравнивают, выясняя, какое из них лучше. В общих чертах можно сказать, что эти два компонента могут иметь общие индикаторы, но электрический усилитель имеет в своем составе электронный блок.

Именно это отличие делает его более функциональным, а его производительность характеризуется следующими показателями:

  • Датчики электронного блока постоянно контролируют указатели скорости движения, считывают его траекторию и контролируют исправность рабочих узлов;
  • После сбора данные передаются в специальный электронный блок управления, где обрабатываются;
  • Искусственный интеллект системы управления изменяет параметры главного цилиндра в автоматическом порядке;
  • Уровень давления масла регулируется только положением клапана, он может быть как открытым, так и закрытым;
  • Насколько большую скорость начинает набирать автомобиль, тем интенсивнее и активнее открывается клапан;
  • В процессе увеличения скорости параллельно увеличивается и жесткость рулевого управления, а это, в свою очередь, увеличивает степень безопасности и устойчивости при движении ВАЗ 2110;
  • Кроме того, наличие топлива не влияет на работу электроусилителя, не влияет на его расход.

Работа ЭМУРУ, то есть электромеханического усилителя руля, направлена ​​на снижение управляющих усилий водителя. Также устройство предназначено для активного возврата управляемых колес и рулевого колеса в исходное положение после маневра. Меньшее количество поворотов рулевого колеса вернет колеса в исходное положение.

Благодаря устройству автомобиль быстро возвращается к прямолинейному движению, что обеспечивает безопасность движения.

Сам агрегат представляет собой модульную конструкцию, встроенную в рулевую колонку.

Модуль состоит из двух основных компонентов:

  • Блок питания — электрическое устройство синхронного характера;
  • Контроллер типа управления.

Установка электроусилителя особенно актуальна, если владелец ВАЗ 2110 устанавливает на колеса большого диаметра более широкие шины, чем стандартные заводские. Исключена такая проблема, как «непослушный» руль при электроусилителе, руль слушается водителю даже при легком прикосновении.

Общая схема электроусилителя руля

Если раньше водителю приходилось постоянно держать руль двумя руками и прикладывать много усилий для его поворота, то теперь все можно делать одним пальцем.

Благодаря этим показателям ВАЗ 2110 считается одним из самых безопасных автомобилей на отечественных дорогах.

Как и любой другой модуль в автомобиле, у электроусилителя есть свои показатели, которые необходимо учитывать. Чтобы было понятно, что это за агрегат, следует указать его технические характеристики:

  • Максимальная компенсация крутящего момента составляет 35 Нм;
  • Потребление тока при среднем Mmax = 35 Нм и частоте вращения рулевого колеса 360 градусов в секунду составляет 50А;
  • Диапазон рабочих температур от — 40 до + 85 градусов Цельсия;
  • общий вес узла равен 9.5 килограмм;
  • Двигатель с электронным управлением — реактивным индуктором;
  • Вращение обратимое;
  • Наличие трех фаз;
  • Установлена ​​червячная передача с тремя проходами;
  • Вал червячный из стали 40х;
  • Колесо червячное изготовлено из углепластика УПА 6 / 30-2.
Рулевая колонка с электроусилителем

Это все характеристики компонента, которые необходимо знать для взаимодействия с ним.Эти показатели особенно актуальны, потому что усилитель является электрическим блоком и с ним нужно быть осторожным.

Электрический руль имеет ряд преимуществ, что привело к тому, что его устанавливают не только на ВАЗ 2110, но и на другие модели этого завода. Помимо технических характеристик имеет другие не менее важные показатели:

  • Простота монтажных работ при установке агрегата;
  • Агрегат потребляет относительно небольшое количество электроэнергии;
  • Узел не влияет на экологические характеристики автомобиля;
  • Возможный установочный узел на другие модели ВАЗ;
  • Параметрические показатели, то есть эффективное уменьшение крутящего момента в соответствии с увеличением скорости автомобиля;
  • В процессе эксплуатации не требуется дополнительного ухода и использования различных специальных материалов;
  • При низких температурных показателях этот вариант усиления руля работает лучше.

ТО единственный недостаток К этому устройству можно отнести то, что он работает немного слабее, чем такой же гидроусилитель.

Новый электроусилитель руля ВАЗ 2110 с комплектующими

Но в случае с отечественными дорогами и этого прироста хватает, чтобы комфортно себя чувствовать за рулем.

Дело в том, что далеко не все автомобили ВАЗ 2110 оснащены этой приятной составляющей, поэтому часто водителям приходится устанавливать усилитель самостоятельно. Эта работа не такая сложная, как может показаться на первый взгляд, и при соблюдении определенных правил может выполняться достаточно эффективно.

Кроме того, можно купить новый электроусилитель даже через интернет и, немного повозившись в гараже, поставить в свою десятку. Поскольку стоимость агрегата не так уж и низкая, сэкономить на установке будет приятно и практично.

Для установки электроусилителя на автомобиль ВАЗ необходимо предварительно подготовить некоторые инструменты и запчасти:

Пластина своими руками Электропроводка
  • Руль и крышка;
  • Отвертки различной конфигурации;
  • Линейка;
  • Сверло.

Никаких масел или других веществ не требуется, так как работа ведется с электричеством, а не с механическими агрегатами … После того, как все компоненты подготовлены, следует приступить к непосредственному монтажу, который будет проходить в следующей последовательности:

  • Необходимо вытащить штатную клемму из колодки и переместить в колодку, расположенную на жгуте проводов;
  • После этого свободный вывод, выходящий из жгута, перемещают на то место, где располагался штатный провод рядом с блоком.Это даст возможность пропустить между жгутами провод стандартного типа. Провод, идущий от блоков, имеет номинал 50 А;
  • Теперь нужно медленно снять крышку рулевого вала, затем снять выключатель зажигания и разъединить выключатели. Делать это нужно медленно, чтобы предотвратить растрескивание кожуха;
  • Аккуратно откручиваем болт крепления рулевой рейки и тут же снимается рейка;
Откручиваем болт на рейке
  • Необходимо измерить длину валов и, если нужно отрегулировать пластину, для этого нужно воспользоваться линейкой и, возможно, даже записать показатели;
  • На освободившееся место устанавливается электроусилитель, для этого нужно подобрать вал нужного размера, так как он не умещается на рейке.Чтобы подогнать вал под нужный размер, пластину и вал перетачивают под валы Приоры. Для этого как нельзя лучше подходят запчасти от ВАЗ «Приора»;
  • После установки вала необходимо просверлить пластину глубже, чем она есть. Сделать это несложно, так как вал представляет собой пустотелую конструкцию;
Перфорированная самодельная пластина
  • Пластина устанавливается на усилитель и таким образом проверяется полученная глубина. Если все нормально, то нужно крепко зажать всю конструкцию болтом поменьше;
Установка пластины
  • Теперь следует установить переключатели на свои места и приступить к электромонтажу.Для этого из салона через левое крыло вывести два провода прямо на аккумулятор;
  • Далее нужно снять бачок омывателя и взять провод. С его помощью необходимо присоединить два выведенных провода. Их нужно прикрепить к концу противоположной проволоки и растянуть оба;
  • Нужно снять панель приборов и вынуть оттуда красный блок, медленно затянуть проводку в пространство под панелью. Затем достаньте из красного ящика провод оранжевый;
  • К этому проводу необходимо прикрепить красную коробку и соединить ее с проводкой электрического усилителя.В этом случае конец с оголенным выводом проводки усилителя помещается на освободившийся стандартный провод в красном блоке;
  • Еще нужно сделать с серым проводом, который тоже выходит из красного блока. Его также необходимо подтянуть на место штатного аналога и закрепить клеммой;
  • Затем нужно перейти к аккумулятору и надежно прикрутить черный провод, то есть МИНУС, к розовому проводу, то есть к ПЛЮСУ;
  • После этого нужно подключить всю проводку электроусилителя руля и завести его или просто скрутить вручную.

Установка электроусилителя завершена, осталось только аккуратно установить все компоненты на свои места.

Для этого нужно переустановить все переключатели и установить крышку и рулевое колесо, которое будет закрывать вал рулевого типа.

Если работы по установке электроусилителя проводит опытный мастер, который может несколько выходить за рамки предложенной инструкции, то следует сказать о том, как устанавливается электроусилитель на ВАЗ 2110.

После выполнения основных действий из приведенного выше списка можно произвести следующую настройку:

  • Выровняйте рулевое колесо;
  • Устранить все зазоры и щели между деталями;
  • Установите светодиодный датчик для диагностики электрического усилителя;
  • Немного укоротите кабель питания;
  • При необходимости замените поврежденные детали и поврежденные детали корпуса.

После этого следует еще раз внимательно осмотреть рулевую систему, сидя в салоне автомобиля.Устранить последние недоработки и натереть полиролью панель и руль. Только после этого можно переходить к дальнейшей эксплуатации авто. Именно соблюдение чистоты и порядка в салоне автомобиля приводит к концентрации водителя за рулем.

Завод-изготовитель АвтоВАЗ не предусматривает ремонт электроусилителя руля, только полную замену в сборе. Поэтому все ремонтные действия владелец автомобиля проводит на свой страх и риск.

Всегда нужно помнить, что ремонт электроусилителя руля ВАЗ 2110 своими руками может привести к аварии!

Цена на электроусилитель руля ВАЗ 2110 и комплектующие:

  • новый электроусилитель стоит в среднем от 13000 до 18000 рублей, можно заказать в интернет-магазинах с доставкой почтой в любой регион России или напрямую с завода;
  • А б / у электроусилитель стоит от 2000 до 6000 руб, в зависимости от состояния, стоит посмотреть на местных досках объявлений, авито.ru и др.

Компоненты для установки также могут продаваться отдельно:

  • вал рулевой для установки электроусилителя руля — цена около 1000 рублей;
  • кронштейн для установки электроусилителя руля — цена около 1000 рублей;
  • жгут проводов для подключения ЭУР — стоимость около 1500 рублей;
  • имитация электронного датчика скорости (для карбюраторных двигателей) — около 1500 руб.

Из приведенной выше информации становится понятно, что евро на ВАЗ 2110 имеет массу положительных показателей, которые сделали его популярным.В процессе эксплуатации этот компонент не требует вмешательства и дополнительных материалов.

Рулевое управление с электроусилителем не требует обслуживания или регулировки. Он отлично показывает себя в морозных российских условиях и его творчество никак не меняется в связи с этим.

Нет необходимости предварительно прогревать автомобиль перед поездкой, а значит, водитель быстрее отправится в путь.

Но наряду с этим у устройства есть и недостатки, хотя в случае с ВАЗ 2110 это не бросается в глаза.У каждого водителя есть возможность самостоятельно решить, какой усилитель ему больше подходит, тем более что электрический усилитель можно установить самостоятельно.

Если есть желание сделать езду на ВАЗ 2110 безопасной и комфортной, то следует отдать предпочтение электроусилителю.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в cookie-файлах может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Сверхбыстрая кинетика сворачивания WW-доменов показывает, как аминокислотная последовательность определяет предел скорости сворачивания белка.

Значение

Природные белки сворачиваются и разворачиваются со скоростью, которая определяет их биологические свойства и сильно варьируется от белка к белку.Главный фундаментальный вопрос касается того, насколько быстро белок может сворачиваться, как этот предел соотносится со скоростью химических реакций и является ли он универсальным или зависит от химических свойств белка. Мы применяем сверхбыстрые кинетические методы для исследования пяти белков, которые имеют простейшую β-складку, но имеют различную аминокислотную последовательность. В этих исследованиях мы измеряем предельную скорость складывания для каждого из них и обнаруживаем довольно существенные различия. Наши результаты проливают свет на основы теории скорости биомолекул и на наше общее понимание того, как белки складываются, функционируют и эволюционируют.

Abstract

Скорость (разворачивания) сворачивания белков зависит от барьера свободной энергии, разделяющего нативное и развернутое состояния, и предфактора, который устанавливает временную шкалу для пересечения такого барьера или ограничения скорости сворачивания. Поскольку выявление этих двух факторов обычно неосуществимо, принято предполагать постоянный предварительный фактор и относить все изменения скорости к барьеру. Однако теория и моделирование постулируют префактор, специфичный для белка, который содержит ключевую механистическую информацию.Здесь мы используем особые свойства быстро сворачивающихся белков, чтобы экспериментально разрешить префактор скорости сворачивания и исследовать, насколько он варьируется среди структурных гомологов. Мы измеряем сверхбыструю (не) кинетику сворачивания пяти естественных WW-доменов с помощью наносекундных лазерных скачков температуры. Все пять доменов WW складываются за микросекунды, но разница между самым быстрым и самым медленным составляет 10 раз. Интересно, что все они производят двухфазную кинетику, в которой более медленная фаза соответствует повторному уравновешиванию над небольшим барьером (<3 RT ), а более быстрая фаза — нисходящей релаксации второстепенной популяции, находящейся на вершине барьера [ансамбль переходных состояний (TSE) ].Высокая скорость повторяет 10-кратный диапазон, демонстрируя, что предел скорости сворачивания даже для простейшего полностью-β-складывания сильно зависит от аминокислотной последовательности. Учитывая простоту этой складки, наиболее вероятным источником таких различий в префакторах является наличие неродных взаимодействий, которые стабилизируют TSE, но должны разрушиться перед возобновлением складывания. Наши результаты подтверждают давние теоретические предсказания и акцентируют внимание на префакторе скорости как на важном элементе для понимания механизмов сворачивания.

В своей естественной среде белки стохастически колеблются между своей предельно стабильной свернутой трехмерной структурой и неупорядоченным ансамблем со скоростью, которая определяет их биологические свойства. Эти скорости, лежащие в основе лежащих в основе механизмов складывания, сильно различаются, в результате чего время складывания и развертывания колеблется от нескольких микросекунд до месяцев (1). Такая огромная изменчивость подчеркивает лежащую в основе механистическую сложность процесса, который включает коллективные движения вокруг тысяч координат белков и растворителей, а также формирование и растворение кооперативных сетей слабых взаимодействий (2).Теория описывает скорость (не) сворачивания белка как диффузию на поверхности свободной энергии, полученную путем проецирования гиперпространственного фазового пространства белок-растворитель (или энергетического ландшафта сворачивания) на один или несколько параметров порядка, которые фиксируют ход реакции (3-5). Поскольку на спроецированных складчатых поверхностях со свободной энергией (FES) обычно видны две метастабильные скважины (естественная и развернутая) (6, 7), такое описание часто сводится к теории скорости Крамерса (8), которая определяет скорость выхода из каждой скважины следующим образом : k = βDωω ∗ 2πexp (βΔG ∗), [1] где D — коэффициент диффузии на вершине барьера, разделяющего две лунки, ω2 — кривизна лунки (в сложенном или развернутом виде), — (ω ∗ ) 2 — кривизна на вершине барьера, β = 1 / kBT (где kB — постоянная Больцмана, T — температура), ΔG ∗ — высота барьера свободной энергии.Здесь важно отметить, что D — это не коэффициент трансляционной диффузии Стокса – Эйнштейна, а эффективный член, который зависит от многих факторов, включая конформационные движения, ответственные за пересечение барьера (9), кинетические связи между конформациями внутри ансамбль переходных состояний (TSE) (10) и энергетическая шероховатость складчатого ландшафта (11). Таким образом, скорость экспоненциально зависит от высоты барьера, тогда как предэкспоненциальный член (или префактор) определяет масштаб времени для пересечения барьера (8).

Одна ключевая проблема при использовании уравнения. 1 состоит в том, что два его члена не могут быть выведены из скоростей, измеренных экспериментально. Соответственно, общепринятая практика заключалась в том, чтобы принять постоянный предварительный фактор или ограничение скорости складывания (12) и сосредоточить внимание на барьерах как на дифференциальном факторе, учитывая их экспоненциальную зависимость от скорости (13). Раньше было даже неясно, какова правильная величина такого префактора скорости сворачивания. Совсем недавно обширные биофизические исследования сошлись на оценке ∼1 / (1 мкс) (14).Эта шкала времени согласуется с многомерными подходами, включая измерения элементарных движений сворачивания (15), экстраполяции скоростей сворачивания по размеру (16) или шкалы времени самого быстрого сворачивания (17) и сворачивания вниз с одним состоянием (18) белков. Доступ к эмпирическим оценкам предела скорости складывания позволил преобразовать скорости в барьеры (19), которые подтвердили ключевые теоретические прогнозы, такие как их энтропийное происхождение и относительно низкая высота (т.е. <10 k B T ) ( 7).Параллельно с этим массированные попытки охарактеризовать сворачивающиеся TSE с помощью мутационного анализа выявили поразительно простое правило, по которому барьер резюмирует примерно одну треть общей естественной свободной энергии стабилизации, независимо от структуры и последовательности белка, положения и типа мутации. (20). Относительные скорости сворачивания и разворачивания могут быть на самом деле достаточно хорошо предсказаны исходя только из размера белка (16) или значительно лучше, просто добавляя их структурный класс (независимо от того, является ли белок α, β или смешанным) (1).

Эти данные намекают на то, что сложные механизмы сворачивания, предсказываемые теорией (21) и наблюдаемые в компьютерном моделировании (22), должны быть в некоторой степени включены в префактор скорости, который, соответственно, должен варьироваться в зависимости от белка к белку. Масштабный анализ скоростей сворачивания указывает на специфичные для белков префакторы сворачивания, особенно для белков β-складок (23). Однако экспериментальный анализ префактора сворачивания является сложной задачей. Одна возможность исходит из методов с одной молекулой, которые могут, в принципе, улавливать статистически редкие события пересечения барьера [или пути перехода (TP)], которым подвергаются белки, колеблющиеся между нативным и развернутым состояниями.Такие сворачивающиеся TP недавно были обнаружены с помощью флуоресценции одиночных молекул (24), оптического пинцета (25) и атомно-силовой микроскопии (26). Несколько ограниченная экспериментальная информация о сворачивании TP, полученная до сих пор, указывает на префактор универсальной скорости (27) с белками, разработанными de novo и, таким образом, не оптимизированными естественным отбором в качестве возможных исключений (28). Здесь мы стремимся исследовать, в какой степени префактор скорости сворачивания или предел скорости варьируется среди естественно эволюционирующих аминокислотных последовательностей, которые укладываются в одну и ту же нативную трехмерную структуру.Наше объяснение состоит в том, что сравнение структурных гомологов должно выявить естественную изменчивость механизмов складывания, которая сосуществует в пределах данной структурной складки. Чтобы исследовать префактор скорости экспериментально, мы используем альтернативный кинетический подход, который специфичен для быстро сворачивающихся белков и который был впервые предложен Грюбеле с соавторами (29, 30). Этот кинетический подход основан на исследовании нисходящей релаксации от вершины барьера (TSE) на белках, которые имеют маргинальные барьеры складчатости, и, таким образом, детектируемых популяциях TSE, с использованием сверхбыстрых кинетических методов.В качестве модельных белков мы используем набор WW-доменов, которые разделяют простейшую антипараллельную топологию β-листов, встречающуюся в природе, и сворачиваются в микросекундной шкале времени (31–34), а также демонстрируют гранично кооперативную термодинамику разворачивания сворачивания вниз. сценарий (35).

Результаты и обсуждение

Проверка префактора складывания экспериментальным путем.

Предварительный фактор сворачивания был получен из экспериментов с отдельными молекулами путем сравнения характерных времен пребывания в нативном или развернутом состоянии ( τ act ) со средним временем TP ( τ TP ) (24) .Существует альтернативный подход, основанный на сверхбыстром кинетическом анализе быстрых папок (29). Микросекундные сворачивающиеся белки пересекают барьеры свободной энергии, высота которых сопоставима с тепловой энергией (т.е. <3 RT ) (36). Эти неглубокие барьеры приводят к незначительным, но значительным популяциям TSE, которые должны повторно уравновешиваться в ответ на возмущения. Нисходящая релаксация от TSE может быть обнаружена кинетически при условии, что метод достаточно быстрый (например, после наносекундного скачка температуры) (рис.1), вызывая двухфазную кинетику релаксации. Быстрая фаза [или «молекулярная фаза» (29)] соответствует нисходящей релаксации молекул, находящихся в TSE, и следует выражению, эквивалентному релаксации на гармонической яме (37) с (ω ∗) 2, представляющим инвертированную кривизну при вершина барьера: kmol = βD (ω ∗) 2. [2] Предполагая аналогичные кривизны для барьера и хорошо, как это было сделано ранее для анализа складчатых TP (24), соотношение между молекулярной скоростью и скоростью релаксации (тем медленнее кинетическая фаза из того же эксперимента), измеренная в средней точке денатурации, становится следующей: кмоль / крел≈π⁡exp (-βΔG ∗), [3] где k отн. равно правому члену в уравнении. 1 умножить на 2 (сумма одинаковых скоростей складывания и развертывания в средней точке). Уравнение 3 непосредственно ведет к барьеру свободной энергии. Предварительный коэффициент скорости затем получается из молекулярной фазы как кмоль / 2π (объединяя уравнения 2 и 1 ). Эти выражения позволяют оценить префактор барьера и скорости на основе измерений температурного скачка, индуцированного наносекундным лазером, на быстро сворачивающихся белках, которые демонстрируют молекулярную фазу.

Рис. 1.

Измерение префакторов скорости сворачивания с помощью сверхбыстрых кинетических экспериментов.На схеме в качестве примера изображена быстрая папка gpW и ее складывающийся ландшафт свободной энергии (50). Панель Left показывает естественные условия (ниже T м ), в которых ландшафт наклонен в сложенное состояние и под уклон. Панель Right показывает ландшафт при средней температуре ( T m ), что приводит к появлению небольшого (<2 RT ) барьера свободной энергии. Подансамбль, который соответствует вершине барьера (TSE) на T м , показан серой полосой с популяциями 10% на низком T и ∼8% на T м .В ответ на индуцированный наносекундным лазером скачок T , который приводит белок к средней точке сворачивания (радужная стрелка), избыточная популяция TSE быстро восстанавливается при нисходящей релаксации к развернутой лунке или молекулярной фазе (зеленый). Избыточная аборигенная популяция медленнее уравновешивается с развернутой скважиной за счет релаксации, которая включает пересечение барьера (синий).

Диапазон скоростей сворачивания природных WW-доменов.

WW домены были очень популярными моделями для экспериментов по быстрому сворачиванию (31–34) и молекулярного моделирования (22, 34, 38), потому что они являются самыми маленькими и самыми быстрыми естественными β белками.По сравнению с самыми быстрыми α-спиральными белками, естественные домены WW, изученные до сих пор, складываются умеренно быстро (около 100 мкс) (39). Несмотря на их сравнительно более низкие скорости, WW-домены имеют тенденцию складываться в рамках сценария спада (барьеры <3 RT ) (40) и могут проявлять молекулярную фазу (33). Согласованность со сценарием даунхилла подразумевает префактор скорости (не) сворачивания, который для β медленнее, чем для спиральных белков, как это было предложено теоретически (23). Тем не менее, мутанты домена FiP35 WW складываются несколько быстрее (30), а вариант, оптимизированный по скорости с помощью вычислительного дизайна, складывается всего за 4 мкс (34).Здесь мы измеряем сверхбыструю кинетику сворачивания пяти WW-доменов, включая три примера из группы I (Nedd4-WW4, Nedd4-WW3 и мутант L30K Yap65-WW1) и двух из группы II (Fbp11-WW1 и Fbp11-WW2). ) (35). Пять доменов имеют заметные различия в последовательности (~ 30% гомологии), но имеют общий размер и топологию складок ( SI, приложение , рис. S1). Детальный термодинамический анализ этих доменов недавно продемонстрировал их минимальную кооперативность и термодинамику, похожую на нисходящую (35).

Мы провели кинетические эксперименты с использованием инфракрасного (ИК) лазера T -jump для исследования вторичной структуры по изменениям поглощения полосы амида I в диапазоне 1,630–1640 см –1 в ответ на температуру <10 нс скачки порядка 10 К ( СИ Приложение ). В этих экспериментах наблюдались микросекундные релаксационные распады для всех WW-доменов (рис. 2 A ). При временах, начинающихся с 1 мкс (время отклика ИК-детектора составляет 600 нс), измеренные ИК-затухания могут быть достаточно хорошо вписаны в одноэкспоненциальную функцию (рис.2 А ). Одноэкспоненциальная аппроксимация отображает скорости релаксации при средней температуре в диапазоне от 1 / (55 мкс) для Nedd4-WW4 до 1 / (10 мкс) для Nedd4-WW3. Однако есть признаки более быстрого, не разрешенного процесса в некоторых экспериментальных трассировках самых медленных папок (см. Ниже). Общая скорость релаксации для каждого белка слабо зависит от температуры, но общий разброс скоростей велик: от 1 / (130 мкс) для FBP11-WW2 при самых низких температурах до 1 / (1,5 мкс) для Nedd4-WW3 и FBP11-WW1 при максимальной температуре зондирования (рис.2 Б ). Слабо зависящие от температуры глобальные (не) скорости сворачивания предполагают, что сворачивание включает пересечение маргинальных барьеров свободной энергии (<3 RT ) (40). Примечательно, что эти пять природных белков покрывают весь диапазон времени (не) фолдинга, ранее наблюдавшегося для WW-доменов. В этом отношении релаксация сворачивания Nedd4-WW3 (рис. 3, темно-синий) сравнима с релаксацией удерживающего рекорда, расчетно разработанного варианта FiP35 [то есть 1 / (4 мкс) при 363 K (34)]. Таким образом, мы можем сделать вывод, что наш каталог белков охватывает вариабельность скорости, обнаруженную в пределах WW, включая естественные и сконструированные варианты.

Рис. 2.

Диапазон скоростей сворачивания по каталогу WW-доменов. Сверхбыстрая кинетика сворачивания пяти WW-доменов, измеренная с помощью индуцированного ИК-лазером метода T -jump. ( A ) Спад релаксации ИК-поглощения при 1,640 см -1 (полоса амида I) для пяти белков в ответ на наносекундные скачки T на ∼10 K до конечной эталонной температуры сворачивания (т. Е. T f ∼348 K для всех, кроме Nedd4-WW3, который был измерен при T f * ∼338 K из-за его более низкой термической стабильности).Цветовой код представлен на вставке в A , как и на рис. S1. Подборки к одноэкспоненциальным функциям показаны серыми линиями. ( B ) Скорость релаксации как функция температуры для пяти WW-доменов. ( C ) Относительная амплитуда ИК-сигнала после T скачков на ∼10 K до конечных температур, показанных на оси абсцисс. Максимум на этом графике указывает на T m (максимальное изменение амплитуды). Кривые в B и C соответствуют подгонке к модели 1D-FES только с использованием данных, показанных в виде закрашенных кружков, чтобы минимизировать отклонения в температурной зависимости скорости, полученной в результате анализа ( SI, приложение , рис.S1 и Таблица S1).

Рис. 3.

Двухфазная флуоресценция T Кинетика скачка показывает складывающуюся молекулярную фазу или префактор скорости. Сверхбыстрый кинетический распад за логарифмическое время, отслеживаемый флуоресценцией Trp в ответ на ∼10 K наносекундный скачок T до конечной температуры около средней средней точки денатурации (343 K). Кривые, как и раньше, имеют цветовую кодировку для каждого белка. Сплошные серые кривые показывают соответствие распадов двухэкспоненциальной релаксации, а штриховые кривые — соответствие медленной фазы одной экспоненциальной в качестве эталона (экстраполяция к нулевому времени обеих кривых указывает амплитуду быстрой или молекулярной фазы. ).Времена релаксации для двух фаз, полученные из двухэкспоненциальной подгонки, показаны с цветовой кодировкой на вставках .

WW-домены сворачиваются-разворачиваются через маргинальные барьеры свободной энергии.

Разброс скоростей на рис. 3 предполагает различия в барьере сворачивания свободной энергии до 2,3 RT от самого быстрого к самому медленному. Однако температурная зависимость скорости релаксации плоская для всех доменов, как и ожидалось для папок с уклоном (40). Чтобы изучить этот вопрос более глубоко, мы проанализировали кинетические данные ИК в пределах окна от 1 до 200 мкс, используя 1D-FES модель сворачивания белка (40, 41).В этой модели термодинамика сворачивания описывается с помощью проекции энергетического ландшафта на единственный локальный параметр порядка: естественность. Кинетическая релаксация описывается как диффузия по этой поверхности, то есть в стиле Крамерса. Комбинация скоростей релаксации (рис. 2 B ) и кинетических амплитуд (рис. 2 C ) как функции температуры обеспечивает всю информацию, необходимую для определения четырех параметров модели ( SI, приложение ). Этот простой кинетический анализ замечательно соответствует экспериментальным данным IR для пяти белков (рис.2 B и C и SI Приложение , таблица S1 для параметров). Интересно, что 1D-FES, возникающие из подобранной модели, похожи для пяти доменов и имеют очень маленькие барьеры свободной энергии (∼1 RT ; SI Приложение , рис. S2). Следовательно, кинетический анализ 1D-FES предполагает, что почти 10-кратное изменение скорости между доменами WW не является результатом различных барьеров, а скорее из-за изменений в префакторе скорости. Ранее сообщалось о больших различиях скоростей в структурно гомологичных белках для доменов спектрина, но в этом случае различия скоростей в основном возникали из-за изменений барьера (42).

Молекулярная фаза и структурные свойства складчатого TSE.

Чтобы исследовать, проявляют ли эти естественные WW-домены молекулярную фазу, мы обратились к лазерным скачкам T с использованием детектирования флуоресценции. Наш флуоресцентный прибор T -jump имеет значительно лучшее временное разрешение и динамический диапазон, чем инфракрасный прибор [10 нс и логарифмическое время (43)], и домены WW имеют сигнатурный сигнал флуоресценции, связанный с их статусом сворачивания, потому что их два остатка триптофана взаимодействуют в конкретных взаимодействиях по листу (35).В экспериментах по флуоресценции T -jump мы действительно обнаружили зависящее от времени красное смещение спектра испускания триптофана (~ 5 нм), связанное с развертыванием пяти доменов. При измерении во всем динамическом диапазоне прибора (от 10 нс до 2 мс) кинетическая релаксация, связанная со спектральным сдвигом, показывает заметно неэкспоненциальные затухания для всех доменов, которые хорошо соответствуют двойной экспоненциальной функции (рис. 3). Параметрический статистический анализ подтверждает, что эти спады представляют собой двухэкспоненциальные, а не одно- или растянутые экспоненциальные функции ( SI Приложение , рис.S3 и Таблица S2). В средней точке денатурации скорости медленной фазы варьируются от 1 / (15 мкс) до 1 / (135 мкс). Эти скорости аналогичны тем, которые измеряются с помощью ИК-детекции (рис. 2), но не идентичны, что указывает на зонд-зависимую кинетику, обнаруженную в других быстро сворачивающихся белках (18). Что еще более важно, дополнительная гораздо более быстрая фаза наблюдается для всех доменов со скоростью в диапазоне от 1 / (0,3 мкс) до 1 / (3 мкс) (рис. 3). Эти два процесса хорошо разделены во времени (примерно в 40 раз), и, таким образом, обе скорости точно определены из двухэкспоненциальных соответствий ( SI Приложение , Таблица S3).Временные масштабы, которые мы получаем для быстрой фазы, согласуются с молекулярной фазой, описанной Gruebele с коллегами для быстрого мутанта лямбда-репрессора (29) и мутантов других WW-доменов (33). Они также согласуются со средним временем сворачивания TP, полученным из экспериментов по флуоресценции одиночных молекул на других белках (27).

Эти наблюдения согласуются с ожиданиями для молекулярной фазы. Однако биэкспоненциальная кинетика сворачивания с небольшой быстрой фазой также может возникать из-за временного накопления кинетического промежуточного продукта, отделенного от развернутого и нативного состояний барьерами свободной энергии (44).Этот промежуточный продукт может появляться либо на нативной, либо на развернутой стороне глобального TSE, что соответствует разворачиванию или складыванию кинетических промежуточных продуктов, соответственно. Чтобы исследовать эти возможности, мы построили линейные кинетические модели с тремя состояниями, которые представляют два промежуточных механизма ( SI Приложение ). Это упражнение по моделированию показывает, что изменения в быстрой фазовой амплитуде являются диагностическими для сценария сворачивания ( SI Приложение , рис. S4). Для промежуточного развертывания амплитуда быстрой фазы после типичного скачка T минимальна до средней точки денатурации ( T m ), после чего она постепенно увеличивается.Обратное верно для складывающегося промежуточного звена. Наши эксперименты по флуоресценции T -jump показывают отчетливую быструю фазу около T m (рис. 3), которая быстро исчезает при более низких и более высоких температурах. Эти результаты несовместимы ни с одной кинетической промежуточной моделью. Напротив, максимальная амплитуда быстрой фазы в средней точке согласуется с изменениями в населении вершины барьера (TSE) для сценария молекулярной фазы ( SI, приложение , рис. S4).Сигнал флуоресценции WW-домена чрезвычайно чувствителен к незначительным изменениям в третичном окружении для двух триптофанов и, таким образом, вероятно, будет специфичным для белка, что согласуется с вариациями в амплитуде быстрой фазы, которые мы наблюдаем среди WW-доменов ( SI, приложение , таблица S3). Напротив, ИК-сигнал, который сообщает об общей водородной связи основной цепи, должен быть более однородным и, вероятно, будет меняться более постепенно с температурой. Временное разрешение нашего ИК-прибора затрудняет измерение быстрой фазы, определяемой флуоресценцией (рис.3, вертикальные линии при 600 нс), что объясняет, почему ИК-переходные процессы, измеренные от 1 до 200 мкс (рис. 3), являются примерно одноэкспоненциальными. Тем не менее, эксперименты по флуоресценции также показывают, что быстрая фаза должна быть разрешена в двух самых медленных папках (YAP65-WW1 и Nedd4-WW4) путем увеличения ИК-обнаружения до предела 600 нс. Мы действительно смогли определить быструю фазу ИК-излучения этих двух областей и подтвердить, что ее амплитуда максимальна при T m . Рис. 4 A C показывает ИК релаксационные распады YAP65-WW1 при трех конечных температурах, а на рис.4 D показывает относительную амплитуду быстрой фазы для двух белков. Эквивалентные переходные процессы для Nedd4-WW4 показаны в Приложении SI , рис. S5. Параметрический статистический анализ подтверждает, что переходные процессы для обоих белков биэкспоненциальны. Подбор двойной экспоненты показывает, что максимальная амплитуда быстрой фазы составляет ∼15–20% около T m и падает до ∼10% при 10 ° ниже или выше ( SI Приложение , Таблица S4). В свете этих результатов можно сделать вывод, что изменения флуоресценции (рис.3) и ИК (рис. 4), связанные с быстрой фазой, отражают повторное уравновешивание значительно заполненного TSE. Эти сигналы демонстрируют согласованные изменения в третичных взаимодействиях (флуоресценции) и водородных связях основной цепи β-слоя (IR). Мы можем заключить, что TSE-конформации YAP65-WW1 и Nedd4-WW4 частично нарушили структуру β-слоя и неродную упаковку двух остатков триптофана. TSE трех более быстрых доменов разделяют сигнатуру триптофановой среды, судя по флуоресценции (с разницей амплитуд, вероятно, отражающих специфические изменения в локальной среде), но мы не смогли получить информацию о статусе водородных связей, поскольку их молекулярная фаза слишком быстрая для ИК-обнаружения. .

Рис. 4.

Амплитуда молекулярной фазы максимальна в середине денатурации. ( A C ) Микросекундное релаксационное ИК-поглощение затухает на 1640 см -1 (полоса амида I) YAP65-WW1 в ответ на ∼10 K наносекундный лазер T перескакивает до конечных температур 321, 332, и 343 K. Подгонки к двойной экспоненциальной функции показаны синим цветом, а одноэкспоненциальный спад, соответствующий медленной фазе, показан красным. Разница между двумя посадками в момент времени 0 отражает амплитуду быстрой фазы.( D ) Относительная амплитуда для быстрой фазы, определенная из экспериментов с прыжком IR T на YAP65-WW1 (розовый) и Nedd4-WW4 (голубой) ( SI Приложение, Рис. S4). Ошибки подгонки двойных экспоненциальных подгонок к переходным процессам от обоих белков приведены в Приложении SI , Таблица S4.

Изменчивость префактора скорости складывания в пределах складки WW.

Кинетические данные на рис.3 показывают сильную корреляцию между скоростями быстрой и медленной фаз для этих WW-доменов ( r = 0.91 с наклоном 1 в корреляции log – log; Рис.5). Такая корреляция демонстрирует, что различия в скоростях (не) сворачивания распространяются почти точно на скорости быстрых фаз, в соответствии с молекулярной фазой (см. Ниже), а не с накоплением промежуточного продукта. Пересечение с ординатой на этом графике указывает среднее отношение между быстрой фазой ( k моль ) и медленной фазой ( k отн ), равное 40. Используя уравнение. 3 , 40-кратное отношение преобразуется в оценочное среднее (не) складывающееся препятствие, равное 2.5 RT для WW фальца. Средний барьер 2,5 RT дополнительно подтверждает классификацию этих белков как зарождающихся катушек спада, но он умеренно выше, чем барьеры, оцененные на основе кинетического анализа 1D-FES (около 1 RT ). Тем не менее, уровень согласованности между оценками кинетического барьера впечатляет, учитывая различные допущения, сделанные для каждой процедуры. Например, кривизна основных состояний и (инвертированный) барьер предполагаются равными в процедуре соотношения скоростей (уравнение. 3 ), но 1D-FES имеют разную кривизну ( SI Приложение , рис. S2). Аналогичным образом, то, как температурная зависимость префактора вводится в модель, влияет на величину барьера, полученного из температурной зависимости скорости. Что наиболее важно, учитывая, что префактор — единственный член, который в равной степени влияет на молекулярную фазу (уравнение 2 ) и активированную медленную фазу (уравнение 1 ), рис. домены возникают не из-за барьера, а из-за ограничения скорости сворачивания, зависящего от последовательности.Дополнительным подтверждением является амплитуда быстрой фазы, которая не уменьшается пропорционально скорости релаксации домена, как это должно быть в случае роста барьера (рис. 3 и SI, приложение , таблица S3). Таким образом, мы можем получить предварительный коэффициент скорости для каждого отдельного белка, просто разделив их молекулярную скорость на 2 π (см. Выше). Этот расчет дает ограничения скорости в диапазоне от 1 / (2 мкс) для FBP11-WW1 (рис.3, красный) до 1 / (19 мкс) для Nedd4-WW4 (рис.4, голубой). Таким образом, мы обнаружили, что предварительный фактор скорости для набора белков быстрой сворачивания, которые имеют общий размер и естественную укладку, варьируется по крайней мере в 10 раз.

Рис. 5.

Скорость молекулярной релаксации в сравнении с ней. Корреляция между скоростью релаксации (медленная фаза: от 65000 до 8000 с -1 ) и молекулярной скоростью (быстрая фаза: от 3 100 000 до 310 000 с -1 ) для пяти WW-доменов (обозначенных цветом, как и раньше), измеренных вблизи T m флуоресцентным методом скачка T .Коэффициенты представлены в виде десятичных логарифмов. Планки погрешностей по обеим осям соответствуют ошибке аппроксимации с доверительной вероятностью 95% от двухэкспоненциальной аппроксимации ( SI Приложение , Таблица S3). Логарифмическая линейная корреляция дает наклон около 1 и коэффициент корреляции r , равный 0,91.

Выводы

Мы показываем, что пять WW-доменов этого исследования представляют собой быстрые папки (рис. 2 и 3). Предыдущий углубленный термодинамический анализ этих доменов показал, что их равновесное развертывание минимально кооперативно и характерно для складчатости вниз (35).Используя две независимые кинетические процедуры, мы обнаружили, что пять WW-доменов пересекают небольшой барьер свободной энергии сворачивания в средней точке денатурации. Кинетический барьер сопоставим с тепловой энергией (<3 RT ), подтверждая, что эти β-белки сворачиваются в рамках сценария спада, но не являются папками с одним состоянием. Аналогичный анализ α-спиральных (45) и смешанных α + β (46) быстрых папок также дал несколько более высокие кинетические, чем термодинамические барьеры. Последовательно более низкие термодинамические барьеры предполагают, что конформации, классифицируемые как члены TSE в соответствии с их структурно-энергетическими свойствами (т.е.е., проекцией свободной энергии) не могут быть напрямую связаны в кинетических микроскопических терминах. Однако общий эффект незначителен, так как он, кажется, объясняет неполные оценки только 1-2 RT на общей скорости складывания и разворачивания.

Второй важный вывод касается величины префактора сворачивания для β-белков. Предел скорости сворачивания, который мы получаем для простейшего β-складывания, составляет 8 (± 6) мкс, что ниже предела скорости для α-спиральных и смешанных α + β-белков (14).С другой стороны, этот предел средней скорости согласуется со средним временем TP, которое Чанг и Итон (27) получили для другого WW-домена с помощью одномолекулярного FRET. Последний был измерен в высоковязких растворах, но как исходные, так и скорректированные данные по вязкости находятся в пределах диапазона, установленного нашими данными. Следовательно, β-складки, по-видимому, имеют более медленные префакторы, чем складки, богатые спиралями. Более медленный префактор для бета-белков теоретически ожидался Тирумалаем с соавторами (23). Здесь мы подтверждаем это предсказание экспериментально.Одной из причин более медленного префактора для β-складок, вероятно, является их потребность в организации вокруг β-витков, что приводит к нескольким продуктивным путям, которые кинетически отсоединены друг от друга, как это наблюдается при моделировании молекулярной динамики (МД) (34). В этом сценарии сворачивающаяся молекула должна вернуться в развернутое состояние, чтобы переключить пути, тонкий кинетический эффект, который уменьшает поток через барьер, что приводит к более медленному эффективному коэффициенту диффузии. Напротив, сворачивание α-спиральных структур начинается со многих альтернативных сайтов зародышеобразования и продолжается посредством широких обменных путей (22, 47).

Наконец, мы обнаружили, что предел скорости сворачивания простейшего антипараллельного β-фолда варьируется по крайней мере на один порядок величины среди естественно возникших белков. Такая вариабельность примечательна, поскольку она происходит не из-за структурных ограничений, а из-за их различий в аминокислотной последовательности (рис. 2). В этом отношении наиболее вероятным фактором является значительный (и переменный) вклад неродных взаимодействий в стабилизацию сворачивания TSE. Ненативные взаимодействия могут захватывать белок при прохождении через барьер, увеличивая энергетическую шероховатость или внутреннее трение (48) и замедляя эффективный коэффициент внутримолекулярной диффузии (т.е., меньший префактор). Электростатические взаимодействия вне регистра вызывают более длительное время TP на разработанном de novo α-спиральном белке, как было определено с помощью экспериментов с одномолекулярным FRET и моделирования MD (28). Здесь, однако, обнаружены различия в префакторе для природных белков, подвергшихся одинаковому эволюционному давлению. Таким образом, кажется, что β-складки более склонны к формированию неродных взаимодействий, возможно потому, что небольшие изменения в положении или геометрии β-витка создают альтернативные структуры, стабилизированные за счет нерегистрации водородных связей основной цепи и гидрофобных взаимодействий, эффект, о котором сообщалось de novo. сконструированные α-β-минипротеины (49).Различия в префакторе, которые мы наблюдаем только в один раз, имеют ту же величину, что и экспериментальная изменчивость скорости, которая остается после поправки на эффекты размера и структурного класса (1), что дает простое объяснение трудностей, обнаруженных при дальнейшем улучшении прогнозов скорости. . Ключевой вывод состоит в том, что префакторы скорости сворачивания содержат важную механистическую информацию, которая упускается из виду в обычных экспериментах. Таким образом, мы должны измерять складчатые TP и / или молекулярные фазы для более широкого каталога белков, чтобы лучше понять их детерминанты укладки и последовательности, а также их связь с лежащими в основе механизмами.Исследование их зависимости от вязкости растворителя также поможет определить, вызваны ли различия в предварительном коэффициенте скорости внутренним трением (48).

Материалы и методы

Расширенное описание материалов, методов и процедур представлено в Приложении SI . Гены, кодирующие последовательности FBP11-WW1 и FBP11-WW2, YAP65-WW1, Nedd4-WW3 и Nedd4-WW4, были клонированы, а белки экспрессированы и очищены, как описано ранее (35). Эксперименты с индуцированным лазером скачком T заключались в создании скачков ~ 10 K с помощью ИК-импульса длительностью <10 нс и отслеживании релаксации белка по ИК-поглощению или флуоресценции.Для ИК-обнаружения мы отслеживали изменения в ИК-полосе амида I (при 1,633 см -1 для Nedd4-WW3 и 1,640 см -1 для других WW-доменов) и использовали образцы с концентрацией ∼1 мМ в 20 мМ. фосфатный буфер (pH 7). Для флуоресценции мы измерили спектр испускания флуоресценции триптофана через последовательность раз после импульса нагревания на образцах белка при концентрации 150 мкМ в 20 мМ натрий-фосфатном буфере (pH 7), содержащем 2% CS 2 в качестве гасителя триптофана.Скорости и амплитуды релаксации, полученные в результате одноэкспоненциальной подгонки экспериментов с прыжком IR T , были проанализированы с помощью 1D-FES модели сворачивания белка, как описано ранее (46).

Благодарности

Это исследование финансировалось грантом ERC-2012-ADG-323059 Европейского исследовательского совета и грантом NSF-MCB-1616759 Национального научного фонда. В.М. также благодарит за поддержку Фонд В. М. Кека и Центр клеточных и биомолекулярных машин Калифорнийского университета в Мерседе (грант NSF-CREST-1547848).

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.