Туран технические характеристики: Технические характеристики автомобилей Volkswagen Touran / Фольксваген Тауран

Фольксваген Туран | Технические характеристики, Расход топлива, Габаритные размеры

Выберите поколение Volkswagen Touran из списка ниже, чтобы просмотреть соответствующие версии.Чтобы ознакомиться с дополнительными техническими характеристиками (такими как мощность двигателя, габариты, вес, расход топлива и т. д.), выберите одну из версий.

Экономичен ли расход топлива Volkswagen Touran?

Автомобили Volkswagen Touran могут быть весьма экономичными, особенно те, которые оснащены дизельными силовыми агрегатами. Наименьший расход обычно достигается у вариантов 2.0 TDI, при этом показатели достигают всего 4,3 л/100 км (54,7 миль на галлон).

Является ли Volkswagen Touran 2015 модельного года доступным с 1.двигатель 9тди?

Нет, вариант 1.9 TDI не входит в модельный ряд Volkswagen Touran второго поколения. Доступны дизельные двигатели 1,6 и 2,0 TDI.

Где производится VW Touran?

Первое поколение собирается на трех заводах: Вольфсбург (Германия), Джакарта (Индонезия) и Антинг (Китай). Второе поколение производится в Вольфсбурге.

Все ли модели Touran 7-местные?

VW Touran поставляется с 5 или 7 посадочными местами.

Танковая энциклопедия, первый онлайн-музей танков

• Аргентинская броня времен холодной войны

Данило Келлер / 17 января 2022 г.

Аргентина (1960-е годы) Легкий танк / средний танк — только проект TAM 1960-х годов до Tanque Argentino Mediano (TAM) [англ.Аргентинский средний…

• Французские небронированные машины времен холодной войны

Мариса Белхоте / 15 января 2022 г.

Франция (1962-~1966) Перевозимый по воздуху автомобиль 4×4 10 приобретен В конце 1950-х и 1960-х годах воздушно-десантные службы ВМС Франции в основном…

• Чехословацкие бронеавтомобили Второй мировой войны

Леандер Джобс / 14 января 2022 г.

 Чехословакия (1918-1935) Броневик — 2 Получен Lancia 1ZM был первым бронеавтомобилем, использовавшимся в Чехословакии.Перед…

Мариса Белхоте / 12 января 2022 г.

Арабская Республика Египет (не позднее 2016 г. — настоящее время) Реактивная система залпового огня (РСЗО) — не менее 24 переоборудованных…

Дэвид Листер / 10 января 2022 г.

Великобритания, 1940 г., передвижной дот — построено около 200 штук. За годы, прошедшие после Второй мировой войны, Bison повсеместно…

Смарагд123 / 8 января 2022 г.

Германия (1940-1942) Огнеметный танк — 151 построено + 1 прототип За пару месяцев до начала Второй…

Энциклопедия танков ®: Направление для любителей танков уже десять лет. 7 000 000 посетителей, более 1 300 страниц

Четыре эпохи, которые мы охватываем:

Первая мировая война: грязь, колючая проволока и окопы Великобритания и Франция начали разработку танков для прорыва вражеских линий. Они предназначались для проникновения на нейтральную полосу, но танк быстро превратился в машину для убийств, интегрированную в общевойсковые операции.

Вторая мировая война: испытательный полигон для бронетехники: Впервые большое количество танков и бронетехники будет сражаться друг с другом.От джунглей тихоокеанских атоллов до засушливых пустынь Ливии, ледяных и ветреных степей Советского Союза и дождливых бокажей Нормандии.

Холодная война: Восток против Запада: Две противоборствующие сверхдержавы привели к расколу мира на Восток и Запад. США и СССР вместе со своими альянсами создали новое поколение бронетехники, извлекая уроки из многочисленных опосредованных войн.

Современная эпоха: танки все еще актуальны?: Несмотря на многочисленные пророчества, предвещающие кончину танков, бронетехника по-прежнему остается важной отраслью вооруженных сил всего мира.Нет никаких признаков того, что это скоро изменится, поскольку разработка танков продолжает адаптироваться к современному полю боя.

Эран уд Туран — Детали танского китайского шелкового пальто, изготовленного…

У меня всегда сложилось впечатление, что Эран уд Туран, помимо акцента на реконструкции предметов и одежды его членами, должен был также в значительной степени оживить древний иранский мир. Становится совершенно ясно, что это очень актуально.

В одном комментарии говорилось, что это «смелый». Я понимаю сочувственный характер этого комментария, но я не согласен — это принципиальная позиция. Это различие имеет решающее значение как по сути, так и по смыслу. Храбрость подразумевает, что в каком-то смысле спорно говорить положительно об иранском культурном наследии и защищаться от преступных замечаний Трампа, как будто противоположное было нормой.То, что написал Трамп, преступно. Выступать против этого, риторически и добросовестно (не в последнюю очередь, с юридической точки зрения), является правильным и корректирующим действием. Это не щепетильность по поводу простых слов.

В конце концов, лучше поговорить об этом и противостоять этому.
Игнорировать — значит не признавать. Это не «политическая позиция» в пользу защиты исторического наследия. Это наш коллективный долг. Это должно быть стандартной позицией всех, независимо от политики.Это просто нормально. Если «политически» быть нормальным и выступать за защиту наследия, то это очень плохо говорит о нашей способности вести эффективный дискурс. Очевидно, что барометр нуждается в корректировке.

Дело не столько в политике, сколько в этике и морали. Учреждения были созданы именно для того, чтобы отодвинуть измерение политики от сохранения, охраны и защиты исторического наследия. Юристы должны разобраться в этом и найти способ привлечь Трампа к суду именно для того, чтобы он не мог играть в политику с наследием и делать заявления, равносильные культурному геноциду, добросовестной правовой концепции.Хватит значит хватит.

Volkswagen Touran 1.6 Технические характеристики, размеры

TURAN и EVA N-опосредованная рецепция пыльцевых трубок синергидами арабидопсиса посредством белкового гликозилирования

Abstract

Рецепция пыльцевых трубок (ПТ) у цветковых растений описывает взаимодействие между мужскими и женскими гаметофитами после прибытия ПТ в синергидные клетки семязачатка.Это приводит к остановке роста PT, разрыву и высвобождению сперматозоидов и, таким образом, необходимо для обеспечения двойного оплодотворения. Здесь мы описываем TURAN ( TUN ) и EVAN ( EVN ), два новых члена пути рецепции PT, который опосредуется рецептороподобной киназой FERONIA (FER) (RLK). Подобно fer , мутации в этих двух генах приводят к чрезмерному росту PT внутри женского гаметофита (FG) без разрыва PT. Картирование с помощью секвенирования следующего поколения, цитологического анализа репортерных генов и биохимических анализов гликопротеинов в мутантах с нокдауном RNAi показало, что оба гена участвуют в N-гликозилировании белка в эндоплазматическом ретикулуме (ER). TUN кодирует белок суперсемейства уридиндифосфата (UDP)-гликозилтрансферазы, а EVN — долихолкиназу. В дополнение к их общей роли во время рецепции PT в синергидах, оба гена имеют различные функции в пыльце: в то время как EVN необходим для развития пыльцы, TUN необходим для роста и целостности PT, влияя на стабильность пыльцы. специфические гомологи FER ANXUR1 (ANX1) и ANX2. Репортеры ANX1- и ANX2-YFP не экспрессируются в пыльцевых зернах tun , но ANX1-YFP деградирует по пути ER-ассоциированной деградации (ERAD), что, вероятно, лежит в основе anx1/2 -подобного фенотипа преждевременного разрыва PT . Мутанты tun .Т.о., как и при взаимодействии сперма-яйцеклетка животных, гликозилирование белков необходимо для взаимодействия между женскими и мужскими гаметофитами во время рецепции PT, чтобы обеспечить оплодотворение и успешное размножение.

Резюме автора

У цветковых растений гаметы образуются гаплоидными многоклеточными мужскими (пыльца) и женскими (зародышевый мешок) гаметофитами, которые развиваются в репродуктивных органах цветка. Успешное оплодотворение зависит от доставки сперматозоидов пыльцевой трубкой в ​​зародышевый мешок, встроенный в яйцеклетку.По прибытии пыльцевой трубки к отверстию семязачатка происходит взаимодействие между мужскими и женскими гаметофитами, известное как рецепция пыльцевой трубки; пыльцевая трубка замедляет или останавливает свой рост, затем возобновляет быстрый рост и, наконец, разрывается, высвобождая сперматозоиды и вызывая двойное оплодотворение. Хотя несколько членов пути рецепции пыльцевой трубки, включая рецептор-подобную киназу FERONIA, были идентифицированы, молекулярные механизмы, лежащие в основе этого процесса коммуникации, остаются неясными.Здесь мы показываем, что N-гликозилирование белка необходимо для нормальной рецепции пыльцевых трубок. Скрининг мутантов идентифицировал два гена, TURAN и EVAN , которые участвуют в N-гликозилировании белка в эндоплазматическом ретикулуме. Оба гена действуют в FERONIA-опосредованном пути рецепции пыльцевых трубок, который нарушен у этих мутантов. Таким образом, у растений для успешной рецепции пыльцевых трубок, по-видимому, необходима «система двойного узнавания», включающая взаимодействия как белковых, так и гликозильных остатков на поверхности мужских и женских гаметофитов, что концептуально похоже на взаимодействие сперматозоидов и яйцеклеток у млекопитающих. N-гликозилирование белков клеточной поверхности также играет важную роль.

Образец цитирования: Линднер Х., Кесслер С.А., Мюллер Л.М., Шимосато-Асано Х., Буассон-Дернье А., Гроссниклаус У. (2015) PLoS Биол 13(4): е1002139. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1002139

Академический редактор: Zhenbiao Yang, Калифорнийский университет, Риверсайд, США

Получено: 29 января 2015 г.; Принято: 19 марта 2015 г.; Опубликовано: 28 апреля 2015 г.

Авторские права: © 2015 Lindner et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в пределах документ и его вспомогательные информационные файлы.

Финансирование: Эта работа финансировалась Цюрихским университетом, грантами Швейцарского национального научного фонда (SNF, 31003AB_126006 и 31003A_141245; www.snf.ch) для UG и частичная поддержка HL и LMM через исследовательские модули программ SNF ProDoc «Молекулярная наука о жизни» (PDFMP3_129948) и «Наука и политика растений» (PDFMP3_137058) соответственно для UG. Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Сокращения:: КонА, конканавалин А; CRP, полипептиды, богатые цистеином; Кр РЛК1Л, Catharanthus roseus Подсемейство рецептороподобных киназ 1; ДАЭ, дней после кастрации; ДАП, дней после опыления; ДАПИ, 4′,6-диамидино-2-фенилиндол; ДЭФЛ, дефензин-подобный белок; Дол-П, фосфодолихол; эээ, Ееарестатин I; ЭФР, EF -Ту-рецептор; ЭндоХ, эндогликозидаза Н; скорая помощь, этанметилсульфонат; Скорая помощь, эндоплазматический ретикулум; ЭРАД, ER-ассоциированная деградация; ЭВН , ЭВАН ; ФА, нитевидный аппарат; ФЭР , ФЕРОНИЯ ; ФГ, женский гаметофит; ФЛС2 , FLAGELLIN-SENSITIVE2 ; ОФП, зеленый флуоресцентный белок; глк, глюкоза; GlcNAc, N-ацетилглюкозамин; GPI, гликозилфосфатидилинозитол; ГТ, гликозилтрансфераза; ГУС, β-глюкуронидаза; Киф, кифунензин; ЖРД , ЛОРЕЛЕЙ ; ЛРР, богатый лейцином повтор; Мужчина, манноза; МЛО , ЛОКУС УСТОЙЧИВОСТИ К ПЛЕСЕНИ O ; НТА , НОРТИЯ ; ПТ, пыльцевая трубка; РЛК, рецептороподобная киназа; РНКи, РНК-интерференция; РОС, активные формы кислорода; СНП, полиморфизм единичного нуклеотида; СРМ, картирование отношения SNP; ТУН , ТУРАН ; УДП, дифосфат уридина; ВТ, дикого типа; YFP, желтый флуоресцентный белок.

Введение

У цветковых растений мужские и женские гаметы входят в состав мужского (пыльца) и женского гаметофита (FG, зародышевый мешок). Сложная серия коммуникационных событий между мужским гаметофитом и женскими тканями цветка необходима для того, чтобы пыльцевая трубка (ПТ) доставила два неподвижных спермия в ФГ [1]. Во время двойного оплодотворения каждый сперматозоид сливается с яйцеклеткой и центральной клеткой, образуя зародыш и эндосперм соответственно.Чтобы достичь FG, встроенного в семязачаток, PT прорастает через стигму, столбик и передающий тракт, входит в яичник и растет вдоль канатика к семязачатку. Градиенты различных небольших органических молекул [2,3], а также более крупные пептиды, продуцируемые синергидами [4], играют существенную роль в направлении PT к FG. Синергиды фланкируют яйцеклетку на микропилярном конце FG и секретируют LURE, малые дефензин-подобные белки (DEFL), которые образуют подгруппу богатых цистеином полипептидов (CRP) [4-6].В трансдукции этих женских сигналов в PT участвуют две рецептороподобные цитоплазматические киназы, LOST IN POLLEN TUBE GUIDANCE1 (LIP1) и LIP2 [7]. После прибытия PT в микропиле он растет за пределы нитевидного аппарата (FA), богатой мембранами структуры на микропилярном полюсе синергид, входит в рецептивную синергиду и разрывается, чтобы высвободить сперматозоиды [8]. Следовательно, взаимодействие между ПТ и синергидами может состоять из двух пространственно и во времени различных стадий. Первый из них представляет собой рецепцию PT в FA, где рост PT временно замедляется или останавливается, а второй включает быстрый рост в направлении места входа PT, разрыв PT и высвобождение двух сперматозоидов с сопутствующей гибелью рецептивной синергиды. 9].

FERONIA (FER), рецептороподобная киназа (RLK) подсемейства Catharanthus roseus рецептороподобная киназа 1 ( Cr RLK1L) [10,11], локализована в FA [12]. У мутантов, лишенных активности FER, развитие синергид нормальное, но fer (или sirene [13], что является аллельным) мутантные FG остаются неоплодотворенными даже PT дикого типа. Таким образом, мутант fer показал, что для приема PT необходим активный сигнальный процесс [10,12,13].В этих неоплодотворенных яйцеклетках PT входит в рецептивную синергиду, но не останавливает свой рост и не разрывается, чтобы высвободить сперматозоиды. Вместо этого рост PT продолжается внутри FG, что приводит к фенотипу чрезмерного роста PT [10,12,13]. Двумя ближайшими гомологами FER являются специфичные для пыльцы гены ANXUR1 ( ANX1 ) и ANX2 [14,15]. Одиночные мутанты anx1 и anx2 не имеют фенотипа, но двойные мутантные PT anx1/2 взрываются in vitro и in vivo вскоре после прорастания [14,15].Передача сигналов через белки ANX активирует НАДФН-оксидазы, которые продуцируют активные формы кислорода (АФК) [16]. Они точно настраивают градиент Ca ²⁺ -на кончике PT, что приводит к устойчивой секреции материала мембраны и клеточной стенки, необходимого для устойчивого удлинения PT [16]. Однако по прибытии ПТ в ФГ -ФЭР -зависимое накопление АФК вокруг ЖК приводит к разрыву ПТ [17]. Таким образом, два ANX RLK, по-видимому, обеспечивают целостность PT до его прибытия в FA, а активация FER -зависимого пути рецепции PT приводит к накоплению ROS и разрыву PT [14,15,17].

Недавно было показано связывание 5 кДа малого пептида RAPID ALKANIZATION FACTOR1 (RALF1) с FER в корнях, где это приводит к фосфорилированию H ⁺ -ATPase 2 плазматической мембраны, регулирующей удлинение клеток [18]. Однако остается неясным, связываются ли экспрессируемые пыльцой RALF-подобные белки с FER в синергидах и активируют ли каскад передачи сигналов рецепции PT. В дополнение к FER было показано, что следующие факторы играют роль в рецепции PT: LORELEI (LRE), синергид-экспрессируемый гликозилфосфатидилинозитол (GPI)-заякоренный белок [19] и NORTIA (NTA), локус O устойчивости к милдью. (MLO) белок семейства, который накапливается в FA FER -зависимым образом после прибытия PT [20].Мутанты lre-1/LRE и nta-1/nta-1 демонстрируют fer -подобный фенотип чрезмерного роста PT в 28% и 22% семяпочек соответственно [19,20]. Кроме того, мутант воздержание по взаимному согласию ( amc ), который влияет на пероксин, участвующий в импорте белка в пероксисомы, проявляет fer -подобный фенотип только в том случае, если мутантные PTs контактируют с мутантными FGs [21]. Этот конкретный фенотип предполагает нарушение связи между обоими гаметофитами из-за отсутствия сигнальных молекул из пероксисом, возможно, АФК.Недавно были идентифицированы первые мужские гаметофитные факторы, влияющие на рецепцию ПТ [22,23]. PT тройного мутанта, нарушающего три фактора транскрипции MYB ( myb97-1 , myb101-4 и myb120-3 ), не могут разорвать и высвободить сперму в 60–70% целевых яйцеклеток [22,23] . Однако гены-мишени этих факторов транскрипции, которые могут участвовать в передаче сигналов, еще предстоит идентифицировать.

Здесь мы описываем двух новых мутантов с нарушенной рецепцией PT, turan (tun) и evan (evn) .Интересно, что растения tun/TUN и evn/EVN демонстрируют один и тот же женский гаметофит fer -подобный фенотип чрезмерного роста PT, но имеют отчетливые дефекты пыльцы. В то время как мутантные пыльцевые зерна evn вырождаются до созревания, мутантные зерна tun развиваются нормально, но PT лопаются сразу после прорастания in vitro, напоминая фенотип anx1/2 . TUN и EVN оба участвуют в N-гликозилировании белка в эндоплазматическом ретикулуме (ER) и кодируют предполагаемый белок надсемейства уридиндифосфата (UDP)-гликозилтрансферазы и долихолкиназу соответственно.Мутанты не влияют на обилие и субклеточную локализацию слитых белков FER, NTA и LRE, указывая на то, что аберрантное гликозилирование может влиять на функцию по крайней мере одного из этих мембранных белков. В мутантных пыльцевых зернах tun ANX1, слитый с желтым флуоресцентным белком (ANX1-YFP), расщепляется по пути ER-ассоциированной деградации (ERAD). Это приводит к преждевременному разрыву PT, указывая на то, что ANX1/2 RLK являются мишенями TUN-зависимого N-гликозилирования.

Результаты

Чтобы лучше понять молекулярные механизмы, участвующие в рецепции PT у Arabidopsis , мы провели прямой генетический скрининг, который дал несколько мутантов, демонстрирующих fer -подобный фенотип чрезмерного роста PT.Три мутанта с самой высокой пенетрантностью были выбраны для дальнейшей характеристики, но два оказались аллельными друг другу (см. ниже). Как и fer , оба мутанта были названы в честь этрусских богинь плодородия и судьбы, а именно turan (tun) и evan (evn) [24]. У tun-1/TUN , evn-1/EVN и evn-2/EVN гетерозиготных мутантов 12% ( n = 1,318), 20% ( n = 1,23) и ( n = 320) семязачатков остались неоплодотворенными соответственно по сравнению с 1.5% ( n = 1,389) у растений дикого типа (табл. 1). В неоплодотворенных яйцеклетках PT продолжал расти внутри FG, не мог остановить его рост и не разрывался, чтобы высвободить сперматозоиды (рис. 1A–1C и S1C).

Рис. 1. Семязачатки tun и evn демонстрируют разрастание пыльцевых трубок и повышенное накопление мозоли в нитевидном аппарате.

(A–C) Окрашивание анилиновым синим каллозы в клеточных стенках PT через 2 дня после опыления (DAP). (A) Прием PT в FG дикого типа.Стрелка указывает место остановки роста PT. (B-C) Избыточный рост PT в tun-1 (B) и evn-1 мутантных FG (C). Звездочки указывают на чрезмерный рост PT. (D–F) Окрашивание β-глюкуронидазой (GUS) синергидного маркера ET2634 через 2 дня после кастрации (DAE) в диком типе (D), tun-1 (E) и evn-1 мутантных FG (F ). Стрелка указывает на аномальную структуру FA. (G – I) Очищение хлоралгидратом семязачатков 2 DAE у дикого типа (G), tun-1 (H) и evn-1 мутантов (I).Стрелки указывают на аномальную структуру FA. (J – L) Окрашивание анилиновым синим каллозы в срезах 6 мкм дикого типа (J), tun-1 (K) и evn-1 яйцеклеток 2 DAE (L). Прямоугольники представляют собой крупные планы указанных областей, при этом крупные планы мутантов в (K) и (L) были получены с уменьшенным временем воздействия по сравнению с диким типом (J). Масштабные линейки в A–F и J–L = 20 мкм; масштабные линейки в G–I = 10 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1002139.g001

Чтобы гарантировать, что фенотип избыточного роста PT не был вызван дефектами клеточной спецификации у этих мутантов, синергидный маркер судьбы β-глюкуронидазы (GUS) (ET2634) был проанализирован.Как в мутантных семяпочках tun , так и в evn экспрессия GUS была ограничена синергидами (рис. 1D-1F), что указывает на то, что их идентичность не была затронута. Однако некоторые семязачатки показали аномальную структуру на микропилярном полюсе синергид (рис. 1Е). Для дальнейшего исследования этой структуры через 2 дня после кастрации (DAE) анализировали окрашивание мембран семяпочек, просветы и срезы. Хотя окрашивание мембран не выявило изменений в общей морфологии синергидов у мутантов (рис. S2 и данные S1), примерно 50% зрелых FG в просветленных яйцеклетках мутантов tun-1/TUN и evn-1/EVN показали аномальная структура в области ЖК (рис. 1G–1I).Используя окрашивание срезов семязачатков анилиновым синим, мы обнаружили, что примерно 50% зрелых FG демонстрируют повышенное отложение каллозы на микропилярном полюсе у обоих мутантов (рис. 1J-1L). Однако это не влияло на привлечение и рецепцию ПТ, так как все семязачатки могли привлекать ПТ, а более 60% мутантных ФГ были оплодотворены. Чтобы выяснить, является ли отложение каллозы в tun и evn FG индикатором защитного ответа [25], экспрессия нескольких генов защитных путей растений была протестирована в мутантных пестиках 2 DAE, но положительной регуляции не наблюдалось. S3 рис).

Таким образом, мы идентифицировали два новых члена пути рецепции PT в синергидах, которые необходимы для успешного размножения. У обоих мутантов синергидная дифференцировка нормальная, но каллоза накапливается на микропилярном полюсе мутантных FG, что, однако, не опосредует нарушение рецепции PT.

Самоопыление мутантных растений tun-1/TUN и evn-1/EVN дало только гетерозиготное потомство и потомство дикого типа.Попытки размножения мутантов путем скрещивания растений дикого типа с мутантной пыльцой также не дали мутантного потомства ( n = 96 растений на мутант; табл. 1). Эти результаты позволяют предположить, что у мутантов tun и evn поражен не только женский, но и мужской гаметофит. Для дальнейшего изучения этой гипотезы растений tun-1/TUN и evn-1/EVN были скрещены с квартетами ( qrt/qrt) мутантов [26,27], где микроспоры не отделялись после мейоза. образуя тетрады пыльцевых зерен.Гетерозиготные мутанты на фоне qrt/qrt облегчают анализ дефектов пыльцы, поскольку в пределах одной тетрады две микроспоры несут аллель дикого типа и две — мутантный аллель. Эксперименты по прорастанию пыльцы in vitro показали, что у мутантов tun-1/TUN развитие пыльцы было нормальным, но 63% ± 1,5% ( n = 441) зрелых PT лопались сразу после прорастания по сравнению с 5% ± 5%. ( n = 128) у дикого типа (рис. 2А–2С и таблица 1). Этот фенотип пыльцы tun напоминает двойные мутанты, разрушающие ANX1/2 , специфичные для пыльцы гомологи FER [14,15].В отличие от дикого типа, где почти вся пыльца была интактной при созревании ( n = 600), 54% ± 5% ( n = 800) пыльцевых зерен дегенерировали перед созреванием в evn-1/EVN . мутантов, что указывает на общие дефекты в развитии пыльцы (рис. 2D и 2E и таблица 1). Окрашивание 4′,6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) на разных стадиях развития показало, что мутантная пыльца evn дегенерирует на ранней трехклеточной стадии ( n = 2,816; рис. 2E и рис. S4G).Мутантные пыльцевые зерна завершили второй митоз с образованием трехклеточной пыльцы, но сравнение с пыльцой дикого типа в пределах той же тетрады в некоторых случаях выявило задержку развития (рис. S4G). Таким образом, созревание пыльцы кажется нарушенным в пыльцевых зернах, лишенных активности EVN .

Рис. 2. Отчетливые дефекты пыльцы у мутантов tun и evn .

(A) Анализ прорастания пыльцы in vitro qrt/qrt пыльцевых зерен. (B) Анализ прорастания пыльцы in vitro tun-1/TUN; кварт/кварт пыльцы.Стрелки указывают разрыв PT. (C) График разрыва PT в пыльце qrt/qrt и tun-1/TUN; qrt/qrt пыльцы. (D) Анализ прорастания пыльцы in vitro evn-1/EVN; qrt/qrt мутантной пыльцы. Стрелки указывают на выродившиеся пыльцевые зерна. (E) График количества дегенерирующих пыльцевых зерен на разных стадиях мутантов evn-1/EVN после окрашивания DAPI. Четвертая стадия относится к двуклеточным и ранним трехклеточным, третья стадия — к трехклеточным, вторая стадия — к поздним трехклеточным и ранним зрелым, а первая стадия — к стадии зрелой пыльцы.Шкала баров: 20 мкм. (F – G) Генная модель TUN (F) и EVN (G) с мутантными аллелями. Однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) этанметилсульфоната (EMS) обозначены линиями, вставки Т-ДНК — треугольниками.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1002139.g002

Взаимные скрещивания мутантов tun-1/TUN и мутантов evn-1/EVN с растениями дикого типа Col-0 показали, что fer -подобный фенотип чрезмерного роста PT был вызван дефектом женского гаметофита.В то время как мутантные семяпочки, оплодотворенные пыльцой дикого типа, показали fer -подобный фенотип чрезмерного роста PT, пестики дикого типа, опыленные пыльцой гетерозиготных мутантов, не показали фенотипа (S5 Fig), как и ожидалось, поскольку не образуются функциональные мутантные PT. Оба дефекта пыльцы evn и tun были полностью пенетрантными (т.е. влияли на жизнеспособность мужского гаметофита и рост PT соответственно) с эффективностью мужской передачи 0% ( n = 96 растений на мутант; таблица 1).Напротив, эффективность передачи самок была снижена до 74,5% ( n = 96) и 28% ( n = 96) у мутантов tun-1/TUN и evn-1/EVN соответственно (таблица 1). ).

В совокупности эти результаты показывают, что мутанты tun и evn демонстрируют отчетливые дефекты мужского гаметофита, влияющие на рост и жизнеспособность мужского гаметофита, соответственно. Однако аномальная рецепция PT вызвана дефектом женского гаметофита, что приводит к снижению передачи мутантных аллелей самкам.

Для выявления причинных мутаций мы разработали картирование SNP-ratio (SRM) [28]. SRM позволяет картировать гетерозиготных мутантов с помощью секвенирования следующего поколения. Вкратце, коэффициенты сегрегации EMS-индуцированных SNP используются для идентификации причинных SNP, которые сегрегируют в соотношении 1:1 в мутантной популяции обратного скрещивания по сравнению с соотношением 1:3 для несцепленных SNP, сегрегирующих на фоне.

Применение SRM к мутантам tun-1/TUN выявило стоп-кодон в шестом экзоне At1g16570 (рис. 2F) [28], который кодирует предполагаемый белок надсемейства UDP-гликозилтрансфераз, принадлежащий к семейству гликозилтрансфераз (GT) 33 , из которых TUN является единственным членом Arabidopsis . У мутантов evn-1/EVN SRM идентифицировал стоп-кодон в одиннадцатом экзоне At3g45040 (рис. 2F и S6, рис. и S1, таблица), который кодирует единственную долихолкиназу в геноме Arabidopsis [29].Таким образом, и TUN , и EVN кодируют белки, которые, вероятно, играют роль в N-гликозилировании белков. В то время как EVN как единственная долихолкиназа может играть общую роль, TUN потенциально действует более специфическим образом, так как всего 27 семейств GT были идентифицированы у Arabidopsis . Наконец, второй аллель evn ( evn-2 ) был обнаружен в том же скрининге EMS и идентифицирован с помощью комбинации SRM (S7 Fig) и классического клонирования на основе карты (S1 Text).Этот аллель имеет преждевременный стоп-кодон в последнем экзоне и демонстрирует такой же разрастание PT (22%; n = 320) и пыльцевые фенотипы (50% ± 0%; n = 200), что и evn-1 (рис. 2F и Таблица 1 и S1C Фиг., S1G Фиг. и S7 Фиг. и S2 Рис.

Для подтверждения того, что были идентифицированы правильные гены, были проанализированы линии инсерций Т-ДНК, нарушающие их. Как описано ранее, аллель Т-ДНК tun-2 (SAIL_400_A01) имеет инсерцию в четвертом экзоне At1g16570 и демонстрирует фенотип чрезмерного роста PT (15%; n = 513; рис. 2F и таблица 1 и S1B рис.) [28] и разрыв PT in vitro (44% ± 6.5%; н = 404; Таблица 1 и S1F фиг.1) аналогичны аллелю EMS tun-1 , подтверждая правильную идентификацию TUN с помощью SRM. Аналогично, evn-3 (SAIL_529_E06) имеет инсерцию в восьмом экзоне At3g45040 и показывает ту же самку (28%; n = 337) и самца (50% ± 0%; n = 495). ) [29] фенотипы в виде мутантов EMS evn-1 и evn-2 (рис. 2G и табл. 1 и рис. S1D и рис. S1H).

Таким образом, TUN и EVN оба кодируют белки, потенциально участвующие в N-гликозилировании белков, что позволяет предположить, что правильное N-гликозилирование белков, участвующих в рецепции PT, имеет решающее значение для диалога гаметофитов во время рецепции PT.

TUN и EVN участвуют в N-гликозилировании белков, и их подавление вызывает различные вегетативные фенотипы

N-связанных белков происходит, когда белки проходят через ER [30]. Чтобы получить представление о субклеточной локализации белков TUN и EVN и подтвердить их идентичность с помощью функциональной комплементации, слияния нативный промотор: белок-зеленый флуоресцентный белок (GFP) трансформировали в мутантные растения. Конструкция pTUN::TUN-GFP дополняла как женский, так и мужской фенотип (таблица 1).В семяпочках самый сильный сигнал GFP наблюдался в FG, включая синергиды, которые демонстрировали сигнал в форме кольца вокруг своих ядер и на всем протяжении PT (рис. S8A-S8C). Конструкция pEVN::EVN-GFP не проявляла экспрессии GFP и не дополняла фенотипы, что позволяет предположить, что конструкция не была функциональной в planta, вероятно, из-за отсутствия регуляторных элементов.

Исследования колокализации p35S::TUN-GFP и p35S::EVN-GFP , в которых слитые белки экспрессировались под конститутивным вирусным промотором 35 S , с различными субклеточными маркерами, были проведены на временно трансформированных луковицах и клетки эпидермиса табака.Они показали ER-локализацию обоих белков (S8D и S8E на фиг.), подтверждая потенциальную роль TUN и EVN в N-гликозилировании белка.

Поскольку гомозиготных мутантов выделить не удалось, мы использовали РНК-интерференцию (РНКи) для подавления экспрессии TUN и EVN с использованием промотора 35 S . Для дальнейшего анализа были выбраны четыре независимых линии TUN(RNAi) и EVN(RNAi) со значительно сниженной экспрессией, до 12% и 13% от уровней дикого типа, соответственно (S9 Fig и S1 Data).Чтобы исследовать функцию TUN и EVN в биохимическом анализе гликопротеинов, потенциальные изменения содержания гликопротеинов в нокдаунных проростках оценивали с помощью лектинового блоттинга с использованием конканавалина А (ConA), который в основном связывается с терминальными маннозильными и глюкозильными остатками гликопротеины. Оба проростка, TUN(RNAi) и EVN(RNAi) , показали измененное количество и подвижность гликопротеинов по сравнению как с диким типом, так и с ost3/6-2 , мутантом, нарушенным в субъединице олигосахарилтрансферазы, которая действует позже в путь гликозилирования (рис. 3) [31].

Рис. 3. ConA выявляет измененные структуры гликопротеинов в проростках TUN(RNAi) и EVN(RNAi) .

Лектиновый блот с использованием ConA дикого типа, трех независимых линий TUN(RNAi) , двух независимых линий EVN(RNAi) и двух контрольных растений ost3/6-2 . Стрелки указывают на полосы дикого типа с различной численностью и/или подвижностью в линиях нокдауна, отмеченных звездочками. Фракция 55 кДа представляет контроль загрузки, окрашенный коммасси-бриллиантовым синим.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1002139.g003

Кроме того, нокдаунные линии TUN(RNAi) демонстрировали вегетативный фенотип, напоминающий мутанты fer/fer (рис. 4) [20,32]. . Тяжесть и частота карликового фенотипа коррелируют с уровнем экспрессии TUN в линиях TUN(RNAi) (фиг. 4C и 4G и S9). Проростки на чашках выглядели нормально, но в почве некоторые растения оставались маленькими, накапливали антоцианы и в конечном итоге погибали без дальнейшего роста (рис. 4С).Возможно, экспрессия TUN у этих проростков была очень низкой, но ее не удалось определить из-за ранней летальности. Эти результаты показывают, что TUN необходим для вегетативного развития. Напротив, растения с нокдауном EVN(RNAi) не демонстрировали явного фенотипа (рис. 4D и 4H и S9), что позволяет предположить, что низкие уровни EVN достаточны для поддержания нормального вегетативного роста.

Рис. 4. линий TUN(RNAi) показывают fer -подобный вегетативно-карликовый фенотип.

(A–D) Размер растения 30-дневных сеянцев дикого типа (A), fer-2/fer-2 (B), TUN(RNAi) (C) и EVN (РНКи) линий (D). Звездочками обозначено проростков TUN(RNAi) , которые накапливают атоцианины и вырождаются без дальнейшего роста. (E–H) Размер взрослых растений дикого типа (E), fer-2/fer-2 (F), TUN(RNAi) (G) и EVN(RNAi) (H) растений . (F) Левое растение находится на той же стадии развития, что и особи дикого типа, TUN(RNAi) и EVN(RNAi) особей.Шкала баров: 1 см. Все линии находятся на фоне Col-0.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1002139.g004

Взятые вместе, и TUN, и EVN играют роль в N-гликозилировании белков, но только TUN , по-видимому, необходимы для нормального вегетативного роста и развития.

Понижающая регуляция

N-гликозилирование белков играет важную роль во многих процессах, включая фолдинг белков, стабилизацию белков, нацеливание на белки [33] и взаимодействия рецептор-лиганд [34].У мутантов tun мы наблюдали избыточный рост PT, подобный fer , вегетативный фенотип, подобный fer , и разрыв PT, подобный anx1/2 . Белки FER, ANX1 и ANX2 имеют несколько предсказанных сайтов гликозилирования [11], что указывает на то, что TUN может быть вовлечен в специфическое гликозилирование этого подсемейства RLK. Чтобы выяснить, требует ли FER TUN для гликозилирования, конструкцию TUN(RNAi) трансформировали в растения, экспрессирующие трансляционный слитый белок pFER::FER-GFP .В случае полного отсутствия потенциальных N-гликанов, связанных с FER, можно было бы ожидать меньший размер недогликозилированного белка FER в проростках TUN(RNAi) по сравнению с диким типом [31]. Однако явных различий в размере, указывающих на потерю гликозилирования, не было обнаружено между FER-GFP в TUN(RNAi) и проростками дикого типа с помощью иммуноблот-анализа с использованием антитела против GFP (S10 Fig). Напротив, явный сдвиг в размере наблюдался, когда FER-GFP дегликозилировался эндогликозидазой H (EndoH, N-гликандегликозилазой с высоким содержанием маннозы) in vitro (S10 Fig).

Эти данные свидетельствуют о том, что FER-GFP не полностью дегликозилирован в проростках TUN(RNAi) . Однако мы не можем исключить возможность того, что остаточные уровни активности TUN в линиях RNAi были способны частично гликозилировать FER в проростках, или что FER-GFP неправильно гликозилирован, а не дегликозилирован.

FER, NTA и LRE не локализованы в

Поскольку tun и evn демонстрируют fer -подобный разрастание PT, мы предположили, что стабильность и/или локализация известных женщин-игроков, участвующих в рецепции PT, могут быть нарушены в мутантных FG tun и evn .Таким образом, репортерные конструкции FER-GFP, NTA-GFP и LRE-Citrine были введены в мутантные фоны tun и evn и проанализированы на предмет изменений в экспрессии и локализации. Сначала анализировали трансляционные слияния pFER::FER-GFP и pNTA::NTA-GFP в tun-2/TUN и evn-3/EVN siliques 2 DAE. В то время как было показано, что NTA-GFP локализуется в везикулоподобных структурах по всей цитоплазме перед оплодотворением [20], FER-GFP локализуется в FA в синергидах [12].Ни NTA-GFP, ни FER-GFP локализация не изменились у мутантов tun и evn (рис. 5A–5F и S11, рис. и данные S1), что указывает на то, что чрезмерный рост PT у tun и evn не вызван неправильной локализацией. ФЭР и НТА.

Рис. 5. NTA, FER и LRE показывают правильную локализацию в мутантных зародышевых мешках tun и evn .

(A–I) Конфокальный микроскопический анализ флуоресцентно меченных белков. (A–C) Локализация NTA-GFP, ассоциированная с везикулами, в цитоплазме дикого типа (A), tun-2 (B) и evn-3 FG (C).(D–F) FER-GFP на ЖК и в мембранах спорофитной ткани дикого типа (D), tun-2 (E) и evn-3 FG (F). (G – I) Внеклеточная локализация LRE-цитрина в диком типе (G), tun-2 (H) и evn-3 FG (I). Шкала баров: 20 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1002139.g005

Хотя для LRE не было доступно репортерного гена, кодирующего предполагаемый GPI-заякоренный белок, гибридизация in situ показала экспрессию LRE преимущественно в синергидах до оплодотворение [19].Слитый белок LRE-GFP не давал обнаруживаемого флуоресцентного сигнала при транзиторных трансформациях [19], возможно, из-за воздействия на GFP кислого pH в апопласте. Однако LRE является хорошим кандидатом в качестве мишени для EVN, потому что дрожжевой мутант, соответствующий evn , secretory59 (sec59) , лишен GPI-заякоренных белков [35]. Поэтому мы получили LRE-репортер с использованием pH-стабильного флуоресцентного белка Citrine [36] и клонировали его между предсказанным сигнальным пептидом и GPI-якорем LRE [19].Слитый белок LRE-Citrine, локализованный на поверхности синергид, отличается от FA-локализации FER-GFP (рис. 5D и 5G). Т.о., LRE-Citrine, вероятно, обращена во внеклеточное пространство по направлению к микропиле, где рецепция PT инициируется по прибытии PT. Однако на продукцию и локализацию LRE-цитрина не повлияли мутанты evn и tun (рис. 5G–5I и данные S11, рис. и S1).

Таким образом, дефекты приема PT в tun и evn FG не вызваны неправильным выражением или неправильной локализацией FER, NTA и LRE.Однако возможно, что функция белка нарушена из-за ошибочно гликозилированных остатков, особенно в FER.

ANX1-YFP и ANX2-YFP не обнаруживаются в мутантных пыльцевых зернах

Чтобы выяснить, вызван ли фенотип разрыва PT tun изменениями содержания и/или локализации белка ANX1/2, мы трансформировали мутантов tun-2/TUN;qrt/qrt с помощью pACA9::ANX1-YFP . и pACA9::ANX2-YFP соответственно, и скрещивали tun-2/TUN;qrt/qrt с растениями, экспрессирующими pACA9::ANX1-YFP [16].Мы проанализировали четыре независимые линии, гомозиготные по трансгену pACA9::ANX1-YFP (поколение T2 или F2), и две независимые линии, гемизиготные по трансгену pACA9::ANX2-YFP (поколение T1) и гетерозиготные по tun-2. соответственно. Хотя мутанты tun-2/TUN были гомозиготными по pACA9::ANX1-YFP , мы всегда обнаруживали экспрессию ANX1-YFP только в двух пыльцевых зернах на тетраду (рис. 6A–6C). Однако в сегрегантах дикого типа можно было наблюдать флуоресценцию гомозиготного pACA9::ANX1-YFP (фиг. 6А).Кроме того, мутанты tun-2/TUN , гемизиготные по pACA9::ANX2-YFP , показали только 30,2% ± 0,7% ( n = 156 тетрад) флуоресцентных пыльцевых зерен по сравнению с 50% ± 0% ( n ). = 150 тетрад) в тетрадах дикого типа. Поскольку под эпифлуоресцентным микроскопом подсчитывали только флуоресцентные тетрады, уменьшение на 50% флуоресценции гемизиготного репортера привело бы к 33,3% флуоресцентных пыльцевых зерен.

Рис. 6. Флуоресценция ANX1-YFP не обнаруживается в мутантных пыльцевых зернах tun .

(A–D) Конфокальный микроскопический анализ экспрессии ANX1-YFP под специфичным для пыльцы промотором. (A) Экспрессия ANX1-YFP в TUN/TUN;qrt/qrt;ANX1-YFP/ANX1-YFP (сегреганты дикого типа, гомозиготные по репортерному гену). (B) Экспрессия ANX1-YFP в TUN/TUN;qrt/qrt;ANX1-YFP/- (сегреганты дикого типа, гемизиготные по репортерному гену). (C) Экспрессия ANX1-YFP в tun-2/TUN;qrt/qrt; мутантных тетрадах ANX1-YFP/ANX1-YFP .Стрелки указывают на отсутствие флуоресценции в пыльцевых зернах tun . (D) Экспрессия ANX1-YFP в tun-2/TUN;qrt/qrt; мутантные тетрады ANX1-YFP/ANX1-YFP после обработки кифунензином (Kif). (E) Экспрессия ANX1-YFP в tun-2/TUN;qrt/qrt; мутантные тетрады ANX1-YFP/ANX1-YFP после имитации обработки для сравнения снижения интенсивности флуоресценции. (F–H) Экспрессия ANX1-YFP в tun-2/TUN;qrt/qrt;мутантные тетрады ANX1-YFP/ANX1-YFP после обработки Eeyarestatin I (EerI).(F) 10 мкм EerI восстанавливает флуоресценцию ANX1-YFP в пыльцевых зернах tun . (G) Более высокие концентрации EerI могут привести к цитозольным включениям (звездочка) или взрыву пыльцевых зерен (стрелка). (H) Восстановление флуоресценции ANX1-YFP в нескольких мутантных тетрадах tun-2/TUN;qrt/qrt;ANX1-YFP/ANX1-YFP после обработки EerI. Остаточный флуоресцентный сигнал от пыльцевой оболочки является аутофлуоресценцией. Шкала баров: 20 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1002139.g006

Таким образом, ANX1-YFP и ANX2-YFP не обнаруживаются в мутантных пыльцевых зернах tun , возможно, потому, что они подвергаются ERAD белков с неправильной укладкой [ 37].Действительно, обработка кифунензином (Kif), ингибитором пути ERAD [38], приводила к восстановлению флуоресценции ANX1-YFP в пыльцевых зернах tun (рис. 6D). Поскольку результаты лечения Kif были переменными, вероятно, в зависимости от того, насколько хорошо препарат поглощался в разных экспериментах, мы также использовали ингибитор ERAD Eeyarestatin I (EerI) [39], что привело к более последовательному восстановлению флуоресценции ANX1-YFP. (Рис. 6F–6H и рис. S12 и данные S1). Эти результаты показывают, что преждевременный выброс tun PT вызван отсутствием ANX1 и ANX2.

Таким образом, TUN , по-видимому, участвует в гликозилировании ANX1-YFP и ANX2-YFP, а аберрантное гликозилирование этих слитых белков приводит к их деградации по пути ERAD. Однако, хотя и менее вероятно, мы не можем исключить, что белки ANX1/2-YFP деградируют, потому что другой белок, необходимый для их стабильности, неправильно гликозилирован и подвержен пути ERAD.

Обсуждение

В этом исследовании мы охарактеризовали двух мутантов, tun и evn , выделенных при скрининге дефектов рецепции PT.Они имеют сходные фенотипы чрезмерного роста PT в FG, но играют разные роли во время развития пыльцы, целостности PT и вегетативного роста. Оба гена кодируют белки, участвующие в гликозилировании N-сцепленных белков, что указывает на то, что эта котрансляционная модификация белков важна для различных процессов развития.

N-связанное гликозилирование влияет на фолдинг, стабильность, транспорт и активность белка [40]. Это многостадийный процесс, начинающийся со сборки олигосахарида, содержащего N-ацетилглюкозамин (GlcNAc), маннозу (Man) и глюкозу (Glc), на фосфорилированном связанном с мембраной полиизопреноидном липидном носителе, долихоле [30].Сборка начинается на цитозольной стороне и заканчивается на люменальной стороне ER с образованием конечного продукта Glc ₃ -Man ₉ -GlcNAc ₂ [30]. Второй этап – котрансляционный перенос олигосахарида на аспарагин в последовательности Asn-X-Ser/Thr, где X может быть любой аминокислотой, кроме пролина [41]. Последним этапом является контроль качества, связанный с ЭР, который обеспечивает правильное сворачивание N-гликозилированных белков и их последующий выход из ЭР [37].

EVN кодирует долихолкиназу, которая играет раннюю роль в пути N-гликозилирования [29].Долихолкиназа SEC59 в дрожжах катализирует цитидин-трифосфат-зависимое фосфорилирование долихола, связанного с мембраной ER [35]. Поскольку EVN может комплементировать дрожжевой мутант sec59 , он, по-видимому, выполняет ту же биохимическую функцию [29]. Фосфорилированный долихол (Dol-P) служит носителем для сборки олигосахаридов на цитозольной стороне ЭР и, кроме того, носителем моносахаридов Man и Glc в просвете ЭР для синтеза GPI-якоря. В Arabidopsis , EVN является единственной копией гена с охарактеризованными ортологами у дрожжей [42], млекопитающих [43,44] и человека [45], где дефицит долихолкиназы приводит к гипогликозилированию и летальности [46,47].Мы никогда не получали гомозиготных мутантов для evn из-за его полной летальности мужского гаметофита. Поскольку растения с нокдауном EVN(RNAi) не проявляют явного вегетативного фенотипа, низкой остаточной активности гена может быть достаточно для нормального роста растений.

TUN кодирует предполагаемый белок надсемейства UDP-гликозилтрансфераз, принадлежащий к семейству 33 GT, единственным представителем которого является TUN в Arabidopsis . Дрожжевой ортолог ALG1 кодирует бета-1,4-маннозилтрансферазу, которая переносит первый Man с субстрата GDP-D-Man на акцептор Dol-PP-GlcNAC ₂ на цитозольной стороне ЭР [48, 49].ALG1 находится в мембране ER, образуя гомодимеры и гетеродимеры с ALG2 и ALG11 соответственно [50]. В непермиссивных условиях чувствительные к температуре мутанты alg1-1 ​​ не продуцируют Man-содержащие олигосахариды [48], что приводит к летальности [51]. Что касается evn , гомозиготных мутантов tun не было обнаружено из-за полной летальности мужского гаметофита. Однако сильный карликовый фенотип и погибающие проростки в линиях TUN(RNAi) указывают на то, что TUN также необходим для вегетативного роста и развития.У растений важность N-гликозилирования белков во время эмбриогенеза, вегетативного развития и защиты растений была продемонстрирована различными фенотипами мутантов N-гликозилирования [52].

Субклеточная локализация слитых белков TUN и EVN в ER и измененные паттерны гликопротеинов, наблюдаемые в линиях РНКи для обоих генов, указывают на то, что растительные белки играют сходную роль в гликозилировании белков, как и их дрожжевые ортологи.

Локализация известных членов рецептивного пути пыльцевой трубки не затрагивается у

Мы показали, что мутации в EVN и TUN в FG приводят к дефектам рецепции PT.Из-за локализации их белков в ER, вполне вероятно, что EVN и TUN напрямую не опосредуют взаимодействия мужского и женского гаметофитов во время рецепции PT, но что нарушенный путь гликозилирования влияет на функцию женских игроков, участвующих в этом процессе. Однако локализация слияний трансляционных репортерных генов с FER, NTA и LRE, тремя известными компонентами пути рецепции PT, не изменилась в FG растений evn-3/EVN и tun-2/TUN . Это неудивительно для NTA-GFP, у которого нет предсказанных сайтов гликозилирования.Однако ожидалось, что флуоресценция LRE-Citrine будет снижена или даже отсутствовать в evn мутантных семязачатках, поскольку дрожжевой мутант sec59 обеднен GPI-заякоренными белками [35]. Однако EVN и SEC59 демонстрируют лишь 22% идентичности аминокислот (ClustalW). Хотя растительный белок способен дополнять мутант дрожжей sec59 [29], эти два белка могут не играть одинаковых ролей в planta и/или другие, неописанные киназы могут взять на себя функцию EVN в мутантных растениях.

Однако нормальное содержание белка и его локализация не обеспечивают должного функционирования. Тот факт, что мутанты tun демонстрируют fer -подобный избыточный рост PT, fer -подобный вегетативный фенотип и anx1/2 -подобный разрыв PT, предполагает, что FER и ANX1/2 RLK затронуты у этого мутанта. . FER имеет девять предполагаемых сайтов N-гликозилирования, восемь из которых находятся во внеклеточном малектин-подобном домене [11]. У Xenopus laevis малектин представляет собой ER-локализованный лектин, который избирательно связывает углеводы и участвует в ER-контроле качества гликопротеинов [53,54].Внеклеточный гликозилированный малектин-подобный домен FER предполагает, что его лиганд может содержать остатки сахара и/или что правильное гликозилирование этого домена необходимо для связывания лиганда. Однако потенциальные дефициты белкового гликозилирования в tun и evn мутантных FG не влияли на полярную локализацию FER-GFP в FA, а подавление TUN не вызывало полной потери N-связанных гликанов в FER-GFP в рассаде. Но возможно, что отсутствуют только некоторые N-гликаны или изменен состав N-гликанов.Следовательно, хотя локализация FER-GFP не затрагивается, могут быть затронуты такие функции, как связывание и/или распознавание лиганда и последующая передача сигнала. Было показано, что это относится к лейцин-богатому повтору растительного иммунитета (LRR) RLK EF -Tu рецептору (EFR), который демонстрирует нарушение связывания лиганда вследствие недостаточного гликозилирования [34]. Совсем недавно в корнях было показано связывание малого пептида RALF1 массой 5 ​​кДа с FER [18]. Однако RALF1 не экспрессируется ни в PT, ни в синергидных клетках.Но в растении имеется 34 RALF-подобных пептида с различными паттернами экспрессии [18]. В случае RALF1 N-гликозилирование, по-видимому, не играет роли в связывании FER, поскольку в процессированном пептиде отсутствует какой-либо предсказанный сайт N-гликозилирования. Из семи RALF-подобных пептидов с высокой экспрессией в пыльце, RALF-подобный4 и RALF-подобный26 являются единственными двумя с предсказанным сайтом N-гликозилирования. Вполне возможно, что, в отличие от животных [53, 54], малектин-подобный лиганд-связывающий домен FER не имеет консервативной способности связывать углеводы у растений.Вместо этого состояние гликозилирования лиганд-связывающего домена рецептора может быть более важным, чем гликозилирование лиганда.

Получение PT в FA необходимо для двойного оплодотворения и, следовательно, успешного воспроизводства. Вполне возможно, что существует «система двойного распознавания», где белковый остов рецептора необходим для взаимодействия с лигандом, которые дополнительно усиливаются N-связанными гликанами, тем самым увеличивая шансы на успешную рецепцию ПТ.Такая система двойного распознавания была описана для взаимодействия гамет у млекопитающих [55], где гликопротеин mZP3 во внеклеточном матриксе яйцеклетки, zona pellucida, отвечает за связывание сперматозоидов [56]. В то время как связывание сперматозоидов улучшается гликозилированными белками mZP3, негликозилированные mZP3 также могут связывать сперматозоиды. Соответственно, белок спермы или белковый комплекс взаимодействует с гликанами и/или белковым остовом mZP3 в зависимости от состояния его гликозилирования. Таким образом, эта система двойной адгезии обеспечивает лучшее связывание сперматозоида с яйцеклеткой, но позволяет взаимодействовать с гаметами, даже если состав гликанов нарушен, увеличивая вероятность успешного оплодотворения [57].У растений существование такой системы двойного распознавания может объяснить пониженную пенетрантность фенотипа чрезмерного роста PT у tun и evn , поскольку женский белковый компонент, даже если он не гликозилирован должным образом, все же может частично распознавать мужской лиганд. Несмотря на сходство фенотипов fer и tun , необходимы дальнейшие биохимические исследования, чтобы выяснить, действительно ли FER RLK и/или другие компоненты пути рецепции PT затронуты у мутанта tun .

ANX1-YFP подвергается деградации по пути ERAD в пыльцевых зернах

Помимо общих с fer фенотипов, tun также демонстрирует anx1/2 -подобный разрыв PT. ANX1 и ANX2 имеют семь и четыре потенциальных сайта N-гликозилирования соответственно [11], при этом все четыре предсказанных сайта гликозилирования ANX2 расположены во внеклеточном домене и сохраняются в ANX1. Флуоресценция ANX1-YFP и ANX2-YFP не обнаруживается в мутантных пыльцевых зернах tun-2 , но флуоресценция ANX1-YFP восстанавливается после обработки двумя ингибиторами ERAD.Это открытие предполагает, что ANX1-YFP неправильно гликозилирован в пыльцевых зернах tun и, следовательно, деградирует с помощью пути ERAD, который индуцируется, когда сворачивание N-гликан-зависимого белка не удается [37]. Неправильно свернутый белок распознается убиквитинлигазами, убиквитинатинилируется, ретротранслоцируется в цитозоль и расщепляется протеасомой [37]. Например, LRR-RLK BRASSINOSTEROID-INSENSITIVE1, который содержит несколько сайтов N-гликозилирования [58], является такой N-гликан-зависимой мишенью ERAD [59,60].

Поскольку слитые белки FER, NTA и LRE не показали каких-либо изменений в количестве или локализации белка в tun мутантных семязачатках, эффект на ANX1-YFP и ANX2-YFP, по-видимому, является специфическим для пыльцы эффектом, а не общей потерей гликозилированных белков в растении. Специфичность ERAD описана для LRR-RLKs EFR и FLAGELLIN-SENSITIVE2 (FLS2), участвующих в врожденном иммунитете растений [61]. Оба LRR-RLK являются N-гликозилированными мембранными белками, но мутации в двух членах пути контроля качества ER повлияли только на EFR, но не на FLS2 [61].Точно так же близкородственные Cr RLK1Ls FER, ANX1 и ANX2 могут быть неправильно гликозилированы у мутанта tun , но только ANX1/2 деградируют по пути ERAD, что объясняет отсутствие ANX1/2-YFP, но нормальное обилие FER-GFP. Это также объясняет разницу в пенетрантности мужских и женских гаметофитных фенотипов; хотя FER, вероятно, неправильно гликозилирован, он все еще локализован в FA, тем самым обеспечивая успешный прием PT в определенной степени, что согласуется с остаточной передачей tun через FG.Напротив, ANX1/2 деградируют по пути ERAD, что приводит к полностью пенетрантному фенотипу, подобному anx1/2 , и полному отсутствию передачи через пыльцу.

Выводы

Характеристика TUN и EVN показала, что N-гликозилирование белка важно для различных процессов развития. Нарушение рецепции PT и anx1/2 -подобный разрыв PT у мутантов tun , по-видимому, связаны с неправильно гликозилированным FER и ANX1/2, соответственно, наиболее близкими членами подсемейства Cr RLK1L RLK.Дефекты рецепции PT, наблюдаемые у гликозилированных мутантов tun и evn , дают первое указание на то, что у растений развились сходные механизмы для обеспечения оплодотворения, как и у млекопитающих, где взаимодействия N-гликан-белок и белок-белок, по-видимому, действуют синергетически, чтобы гарантировать связывание гамет и, таким образом, увеличивает вероятность успешного оплодотворения.

Материалы и методы

Растительный материал и условия роста

Условия выращивания растений соответствовали описанию [62].Линии вставок Т-ДНК были получены из Ноттингемского Arabidopsis Stock Center (NASC). Мутант qrt1-2/qrt1-2 [26] был подарен Дж. Ф. Харпером (Университет Невады, Рино). Линии pACA9::ANX1-YFP , pACA9::ANX2-YFP , pFER::FER-GFP и pNTA::NTA-GFP были описаны ранее [12,16,20]. Скрещивания проводили путем кастрации цветочных почек дикого типа Col-0, tun/TUN и evn/EVN с последующим опылением соответствующей пыльцой 2 DAE.Идентификация аллелей EMS, процедуры клонирования, генотипирование и анализ экспрессии генов описаны в тексте S1.

Окрашивание анилиновым синим

Для визуализации PT были выбраны стручковые волокна около 2 DAP. Чашелистики и лепестки удаляли, а стручки фиксировали в смеси 9:1 этанол (EtOH):уксусная кислота в течение ночи при 4°C. Окрашивание анилиновым синим было описано ранее [10], а анализ образцов проводили с использованием эпифлуоресцентного микроскопа Leica DM6000B. Каллозное окрашивание полутонких срезов семязачатка описано в тексте S1.

Анализ прорастания пыльцы in vitro

Прорастание пыльцы in vitro было описано ранее [14]. Пыльцевые зерна и пробирки визуализировали с помощью дифференциального интерферирующего контраста на микроскопе Leica DM6000B.

FM4-64 Окрашивание мембран

, tun-2/TUN и evn-3/EVN вырезали в охлажденном на льду 100 мМ растворе красителя FM4-64 (Life Technologies) на предметных стеклах микроскопа, а семязачатки покрывали покровным стеклом. .Предметные стекла микроскопа накрывали алюминиевой фольгой и оставляли на льду на 3–4 часа. Флуоресценцию мембран семяпочек анализировали с помощью конфокального микроскопа Leica SP5.

Очистка яйцеклеток

кастрировали и собирали 2 DAE, разрезали по бокам в продольном направлении и фиксировали в смеси 9:1 EtOH:уксусная кислота в течение ночи при 4°C. Образцы промывали в серии EtOH (85%, 70%, 50% и 30% в течение 30 минут каждый) и осветляющем растворе (хлоралгидрат:глицерин:вода (8:1:2, вес:об:об)) добавлен.Силикаты разрезали, а семязачатки анализировали с использованием микроскопа Leica DMR.

Окрашивание β-глюкуронидазой (GUS)

Синергидный маркер ET2634 [63] скрещивали с мутантами tun-1/TUN и evn-1/EVN . Гомозиготных особей F2 кастрировали, а стручковые волокна окрашивали на экспрессию GUS 2 DAE, как описано ранее [20]. Окрашенные образцы препарировали и анализировали с помощью микроскопа Leica DMR.

Вестерн-блоттинг и анализ дегликозилирования

Экстракция белка из 10-дневных проростков (приблизительно 400 растений дикого типа, tun-2/TUN и evn-3/EVN , несущих pFER::FER-GFP и ost3/6 -2 (SALK_067271)) проводили путем их измельчения в мешалке и добавления буфера для экстракции (50 мМ трис, pH 7.5, 10 мМ NaCl, 0,5% Triton X-100 и таблетку коктейля ингибиторов протеазы Complete Mini (Roche)). Экстракты инкубировали на льду в течение 15 мин и центрифугировали в течение 3 мин при 14000 об/мин (центрифуга Eppendorf 5424 с FA-45-24-11). Белковые экстракты кипятили при 95°C с буфером для загрузки SDS (63 мМ Tris-HCl (pH = 6,8), 15% глицерина, 2% SDS, 0,15% бромфенолового синего, 7 мМ DTT) и наносили на 10%-й гель с последующим SDS-PAGE в восстанавливающих условиях. После блоттинга на мембрану PVDF (Millipore Immobilon Transfer Membrane) мембрану блокировали в 5% молоке в TBST (20 мМ Трис (pH = 7.4), 150 мМ NaCl, 0,05% Tween-20), и зондировали антителом против GFP B-2 (Santa Cruz Biotech), промывали TBST, обрабатывали вторичным антителом (козье антимышиное, конъюгированное с пероксидазой хрена [Pierce] ) и обнаруживают с помощью хемилюминесценции (SuperSignal West Dura [ThermoScientific]). Для обнаружения ConA (Sigma-Aldrich) гель SDS наносили на мембрану PVDF и маркировали в соответствии с рекомендациями производителя. Для оценки количества белка восстанавливающий SDS-гель окрашивали раствором кумасси бриллиантового синего R250 (Fluka) (0.1% кумасси, 10% ледяной кислоты, 40% метанола) и обесцвечивают раствором для обесцвечивания (20% метанол, 10% уксусная кислота). Расщепление EndoH (New England Biolabs) проводили в соответствии с инструкциями производителя в восстанавливающих условиях.

Конфокальная микроскопия

Конфокальная микроскопия была описана ранее [20], за исключением того, что использовался конфокальный микроскоп Leica SP5.

Лечение кифунензином

срезали с растения и инкубировали в 50 мкМ растворе Kif (Sigma-Aldrich).Через 2 сут при постоянном освещении при 22°С флуоресценцию зрелых пыльцевых зерен анализировали с помощью конфокального микроскопа Leica SP5.

Лечение эяарестатином I

Пыльники цветочных почек (около 11 стадии) вскрывали и пыльцевые зерна помещали на среду для прорастания пыльцы [14], содержащую различные концентрации EerI (Sigma). Пыльцу инкубировали в течение 20 ч при 22°С во влажном инкубационном боксе. Флуоресценцию пыльцевых зерен анализировали с помощью конфокального микроскопа Leica SP5.

Вспомогательная информация

S1 Рис. Дополнительные аллели подтверждают женский и мужской гаметофитные фенотипы.

(A–D) Окрашивание анилиновым синим каллозы в клеточных стенках PT 2 DAP. (A) Нормальный прием PT в FG дикого типа. (B-D) Избыточный рост PT в tun-2 (B), evn-2 (C) и evn-3 мутантных FG (D). Звездочками отмечен фенотип чрезмерного роста PT. (E–H) Анализ прорастания пыльцы in vitro. (E) Нормальное прорастание пыльцы дикого типа. (F) Фенотип взрыва PT в tun-2/TUN;qrt/qrt .Стрелки указывают разрывные ПТ. (G) Дегенерированный фенотип пыльцы в evn-2/EVN;qrt/qrt . (H) Дегенерированный фенотип пыльцы в evn-3/EVN;qrt/qrt . Стрелки указывают на выродившуюся пыльцу. Шкала баров: 20 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1002139.s001

(PDF)

S2 Рис. Морфология синергид сходна в зародышевых мешках дикого типа,

(A–B) Окрашивание FM4-64 мембран семязачатков (пестики 2 DAE).(A) Яйцеклетка с нормальными синергидными клетками. (B) Семяпочка дикого типа с косо ориентированными синергидными клетками. Сокращения: CC: центральная клетка, EC: яйцеклетка, Sy: синергидная клетка, FA: нитевидный аппарат. (C) Количественная оценка двух морфологических типов в семязачатках дикого типа, tun-2/TUN и evn-3/EVN .

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1002139.s002

(PDF)

S3 Рис. Отложение каллозы в семязачатках

ОТ-ПЦР ЗАЩИТА РАСТЕНИЙ1 . 2 ( pdf1 . 2 . 2 ), участвующие в ответственном отклике, зависящем от JASMONATE, , связанный с патогенезом ( PR1 ), вовлеченные в системное приобретенное сопротивление, PR5 и фенилаланина аммиака-Lyase1 ( PAL1 ), участвующий в реакции салициловой кислоты, в evn-1/EVN , tun-1/TUN , evn-2/EVN и пестиках дикого типа 2 DAE, и в контроль рассады.Цифры справа указывают количество циклов амплификации. ACTIN11 служит для контроля экспрессии.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1002139.s003

(PDF)

S4 Рис. Окрашивание по Александеру и DAPI выявило различные фенотипы пыльцы в мутантных пыльцевых зернах